房巖強 魏益民 張 波

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

蛋白質的螺桿擠壓過程通常被認為是蛋白質四級結構、三級結構和二級結構變化的結果［1］。在機械能和熱能的作用下，蛋白質分子維持高級結構的非共價鍵被破壞，分子逐漸展開呈鏈狀結構，并順著物料運動方向取向［1－3］。在取向過程中，蛋白質分子與蛋白質分子或其他分子之間再隨機發(fā)生各種化學作用?；瘜W作用主要可能發(fā)生在分子側鏈之間，其結果是形成網(wǎng)狀結構，并呈現(xiàn)出各向異性，即在平行于運動方向的強度較大，而垂直于運動方向的強度較弱［4－6］。由于體系中蛋白質分子較多，因此蛋白質分子間作用形成的聚合體可能是骨架，其他分子則填充在骨架之間［7］。

研究和明確螺桿擠壓過程中蛋白質分子結構的變化，可為控制擠壓過程中蛋白質的變性提供理論依據(jù)，從而有利于改進擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和提高產(chǎn)品質量。另外，通過擠壓過程中蛋白質分子結構變化的研究對于闡明擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的形成機理具有指導意義。本文從蛋白質組分、分子質量、共價鍵以及二級結構等方面總結了蛋白質結構在螺桿擠壓過程中的變化。

1 蛋白質的組分及分子質量的變化

植物蛋白，如大豆蛋白、小麥蛋白、花生蛋白等是擠壓組織化蛋白生產(chǎn)的主要原料。植物蛋白依據(jù)其溶解性，可分為清蛋白（albumin）、球蛋白（globulin）、醇溶蛋白（prolamin）、谷蛋白（glutenin）和殘渣蛋白（residue）［8］。擠壓過程中，蛋白質分子變性，溶解性等理化特性發(fā)生變化，表現(xiàn)出蛋白質組分比例的變化。對于擠壓后蛋白質組分及分子質量的變化，研究者一方面比較關注擠出蛋白的組分及分子質量分布；另一方面，研究者比較關注的是不同蛋白質組分與擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結構形成的關系。

不同擠壓原料，5種蛋白質組分含量有所不同，如小麥蛋白主要以谷蛋白和醇溶蛋白為主，而大豆蛋白主要以球蛋白為主。目前，大多數(shù)研究表明，擠壓后，原料中的主要蛋白質組分含量顯著降低，而殘渣蛋白含量顯著增加。Gujska等［9］采用Osborne的蛋白質組分提取方法，對不同溫度（110、135、150℃）擠壓后的菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量進行了研究，結果表明，各種溫度擠壓處理后，菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量都顯著降低，而殘渣蛋白含量均顯著增加。擠壓后菜豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了59%～84%和70%～93%，而殘渣蛋白增加了221%～288%。斑豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了77%～80%和92%～94%，而殘渣蛋白增加了253%～264%。Alonso等［10］對擠壓前后豌豆和四季豆中清蛋白和球蛋白的含量進行了類似研究，結果表明，擠壓后豌豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了41%和78%，而殘渣蛋白增加了226%。四季豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了64%和85%，而殘渣蛋白增加了224%。Li等［11］通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）對小麥蛋白擠壓前后的組分分布進行了研究，結果表明，擠壓后麥谷蛋白和麥醇溶蛋白含量顯著降低，殘渣蛋白顯著增加。

擠壓過程中，蛋白質組分的變化與不同組分氨基酸的組成有較為密切的關系。清蛋白和球蛋白大多是生理活性蛋白質，含較多的賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸；醇溶性蛋白和谷蛋白是貯藏性蛋白，脯氨酸和谷氨酰胺含量較高，賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸含量較低。Li等［11］發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白擠壓過程中，分子質量位于45～66 ku的麥醇溶蛋白受高溫擠壓影響較小，認為可能是由于這部分麥醇溶蛋白所含疏水性氨基酸或半胱氨酸較少，擠壓過程中，它們不能通過疏水作用或二硫鍵發(fā)生聚合。Fischer［12］對小麥蛋白擠出物研究后也有類似發(fā)現(xiàn)。Fischer的結果表明，麥醇溶蛋白與蛋白質網(wǎng)的形成高度相關，但不同種類麥醇溶蛋白與其的密切程度不同。擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結構的形成主要與α－麥醇溶蛋白和γ－麥醇溶蛋白有關，與ω－麥醇溶蛋白關系較小。這是由于ω－麥醇溶蛋白缺少巰基基團，不能通過二硫鍵發(fā)生聚合。但Fischer又認為ω－麥醇溶蛋白仍可能通過非二硫鍵的聚合對蛋白質網(wǎng)絡形成發(fā)揮一定作用。

螺桿擠壓過程中，分子質量變化是導致蛋白質理化特性改變的重要原因，例如分子質量或分子尺寸的增加往往導致蛋白質溶解性的降低［11］。擠壓過程中既有蛋白質的降解，又有蛋白質的聚合［12－14］，因此，蛋白質分子質量的變化較為復雜。對于擠壓過程中蛋白質分子質量變化的研究，目前多采用聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳法，考察蛋白質亞基分子質量分布的變化。對于蛋白質真實分子質量變化的研究還很有限［15］。

Alonso等［10］通過 SDS－PAGE對豌豆和腰豆擠壓前后的蛋白質片段進行了分析。結果表明，擠壓后，豌豆原有的 75、50、38、25、22 ku的電泳條帶變得模糊，而新出現(xiàn)了34、14 ku的蛋白片段；腰豆原有的45、31 ku的電泳條帶消失，新生成了分子質量為14～22 ku的蛋白片段［6］。Chiang［16］通過 SDS－PAGE對大豆擠壓前后的蛋白質片段進行了分析。結果表明，擠壓后大豆原有的42 ku的7S球蛋白亞基消失，而34～44 ku11S球蛋白亞基的含量顯著增加。陳鋒亮［17］對大豆蛋白擠出物的亞基條帶分析后，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白 7S／11S的亞基比例顯著降低。Anderson等［13］通過SDS－PAGE對小麥蛋白擠壓前后的蛋白質片段進行了分析。結果表明，擠壓后蛋白質的亞基分布呈現(xiàn)出由高分子質量向低分子質量轉變的趨勢。徐樹來［18］通過SDS－PAGE對米糠蛋白擠壓前后的蛋白質片段進行了分析。結果表明，擠壓后米糠蛋白質的分子質量整體降低。

擠壓后，原料中的主要蛋白質組分含量顯著降低，殘渣蛋白含量顯著增加。但擠壓處理對ω－麥醇溶蛋白等不含硫氨基酸片段影響較小。擠壓后，蛋白質的亞基分子質量分布呈現(xiàn)出向小分子質量轉變的趨勢，這可能是由于蛋白質分子受到高溫和剪切力的作用后，各亞基產(chǎn)生分離引起的［19］。

2 蛋白質共價鍵的變化

螺桿擠壓破壞了蛋白質分子與蛋白質分子或其他分子之間舊的化學鍵和相互作用，并通過形成新的化學交聯(lián)，使得肉類似物得以形成。肽鍵和二硫鍵是蛋白質結構維持中的主要共價鍵。它們也是擠壓過程中蛋白質分子作用力變化的重要研究對象。

擠壓過程中是否有異肽鍵的形成，即維持擠壓產(chǎn)品結構的作用力中是否有異肽鍵一直是研究者爭議的焦點。Burgess等［20］認為，擠壓過程中，大豆蛋白分子間有新的肽鍵（異肽鍵）形成，新形成的異肽鍵是維持擠壓產(chǎn)品結構的最主要化學鍵，而二硫鍵的作用可以忽略。Hager［21］以大豆?jié)饪s蛋白為原料，對維持組織化產(chǎn)品化學作用力的主要類型進行了分析。結果表明，擠壓過程中沒有異肽鍵的生成，疏水作用、氫鍵和分子間二硫鍵是維持擠壓產(chǎn)品結構的三種主要化學作用。這與Burgess等的結論截然相反。Hager認為，這可能是由于擠壓溫度不同所致。Burgess等采用的擠壓溫度為150～190℃，而Hager采用的最高溫度僅有150℃。后來，Prudêncio－Ferreira等［22］系統(tǒng)研究了擠壓溫度（140～180℃）對蛋白質分子作用力的影響。結果表明，二硫鍵和非共價鍵作用是維持擠壓產(chǎn)品結構的主要作用力，即使180℃條件下擠壓后，維持組織化產(chǎn)品的作用力中也沒有異肽鍵。當前大多數(shù)研究表明，組織化產(chǎn)品網(wǎng)狀結構的維持主要通過二硫鍵和非共價鍵作用，而沒有異肽鍵的參與［23－26］。

自由巰基和二硫鍵含量變化的研究是探討二硫鍵作用的重要途徑。Burgess等［20］對大豆?jié)饪s蛋白擠壓前后自由巰基和二硫鍵含量測定后發(fā)現(xiàn)，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由4．5×10－8mol／mg降至0．9×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 3．3×10－8mol／mg升高到 48．9×10－8mol／mg。因此，他們認為擠壓會嚴重破壞二硫鍵的形成。Hager［21］在水分為27%擠壓溫度140℃條件下考察了擠壓對大豆分離蛋白自由巰基和二硫鍵含量的影響。結果表明，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由22．7×10－8mol／mg降至19．6×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 0．5×10－8mol／mg升高到4．1×10－8mol／mg。當前，大部分研究結果與他們的研究基本一致。即擠壓處理對二硫鍵有破壞作用，并引起自由巰基含量的增加［11，13，22］。

擠壓溫度是影響蛋白質自由巰基和二硫鍵含量的重要因素［22，27－28］。Prudêncio－Ferreira等［22］分別對140、160、180℃擠壓處理后大豆分離蛋白擠出物中自由巰基和二硫鍵的含量進行了測定。結果表明，140℃擠出物中的二硫鍵含量與原料相比基本沒有變化（增加了0．2%），160、180℃擠出物中二硫鍵的含量相比原料分別降低了17%和25%；自由巰基含量在各溫度處理后相比原料都有顯著增加，分別增加了42%、76%和 122%。Fischer［12］分別對 140、160、180℃擠壓處理后小麥蛋白擠出物中自由巰基的含量進行了測定。結果表明，自由巰基含量在各溫度處理后都有顯著增加，分別增加了107%、113%和348%。Rebello等［29］分別對160、185℃小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量進行了測定。結果表明，擠壓溫度對小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量具有負影響。張汆［27］分別對 100、120、140、145、150、155℃擠壓處理后花生蛋白擠出物中的二硫鍵含量進行了測定。結果表明，當擠壓溫度低于150℃時，擠出物中的二硫鍵含量相比原料基本沒有變化，但155℃擠壓處理后，擠出物中二硫鍵含量相比原料顯著降低?？梢姡瑪D壓溫度對二硫鍵含量具有負影響，對自由巰基含量具有正影響，特別是當擠壓溫度大于160℃時，溫度對自由巰基和二硫鍵含量變化的影響更為明顯。

擠壓過程中，自由巰基和二硫鍵含量的變化同時受到水分含量的影響。Prudêncio－Ferreira等［22］發(fā)現(xiàn)，當水分由30%升至40%時，大豆分離蛋白擠出物中自由巰基含量由 5．42×10－10mol／mg降低至4．37×10－10mol／mg，二硫鍵含量由249．9×10－10mol／mg升高至278．0×10－10mol／mg。表明水分含量對二硫鍵有正影響，對自由巰基有負影響。Fischer［12］以小麥蛋白為原料也進行了水分含量對自由巰基含量影響的研究。結果也表明，水分含量對自由巰基有負影響。當水分由20%升至24%時，擠出物中自由巰基含量由 11．82×10－9mol／mg降低至 4．59×10－9mol／mg。

擠壓過程中，機械剪切也是影響自由巰基和二硫鍵含量的重要因素。理論上分析，機械剪切對二硫鍵的形成具有相反的兩方面作用。一方面，機械剪切可以導致蛋白質分子更多的巰基基團暴露；在氧氣的參與下，巰基基團發(fā)生氧化反應，從而促進二硫鍵的形成。另一方面，機械剪切憑借物理剪切作用，打斷蛋白質分子之間的二硫鍵，降低二硫鍵的含量［30－31］。因此，機械剪切對自由巰基和二硫鍵含量的影響會因機械剪切強度的不同而產(chǎn)生差異。Fischer［12］發(fā)現(xiàn)，當單位機械能耗（SME）由 32．1 Wh／kg升至41．1 Wh／kg時，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由 20．54×10－9mol／mg降 低 至 8．68×10－9mol／mg。Rebello等［29］發(fā)現(xiàn)，當 SME由 302 kJ／kg升至656 kJ／kg時，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由7．7×10－9mol／mg升高至 21．6×10－9mol／mg，而二硫鍵濃度由51．5×10－9mol／mg降低至 43．1×10－9mol／mg。

擠壓過程中沒有異肽鍵產(chǎn)生。擠壓過程中，擠壓溫度、水分含量和機械剪切強度對二硫鍵的形成都具有重要影響。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負影響，對自由巰基含量具有正影響；當擠壓溫度大于160℃時，自由巰基和二硫鍵含量的變化更顯著。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負影響。

3 蛋白質二級結構的變化

蛋白質的二級結構是指多肽鏈借助氫鍵作用排列成為沿一個方向、具有周期性結構的構象，以α－螺旋、β－折疊、β－轉角和無規(guī)則卷曲最為常見［32］。擠壓過程中，蛋白質分子去折疊化，相對線性化，蛋白質的二級結構遭到破壞。其研究焦點在于擠壓后蛋白質的有序二級結構是否完全喪失，即破壞的程度。

Yuryev等［33］較早通過紅外光譜技術對大豆分離蛋白擠出物構象進行了觀察。結果表明，擠壓后，蛋白質 β－折疊結構含量增加。Prudêncio－Ferreira等［22］對不同溫度（140、160、180℃）和水分含量（30%和40%）條件下大豆分離蛋白擠出物進行了紅外光譜分析。結果表明，所有擠出物中都含有β－折疊結構。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，分別對120、140、160℃條件下大豆蛋白擠出物的二級結構變化進行了紅外光譜分析。結果也表明，擠壓后，大豆蛋白沒有完全線性化，或完全轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結構，一定的有序結構（β－折疊和β－轉角）仍被保留。但 Qi等［34］以圓二色光譜對不同溫度（50、75、100℃）和水分條件（20%～50%）下乳清分離蛋白擠出物的二級結構研究后發(fā)現(xiàn)，50℃的擠出物與原料相比，二級結構基本沒有變化；當溫度升至75℃，蛋白質有序二級結構的含量開始顯著降低；當溫度達100℃時，蛋白質已只剩下無規(guī)則卷曲結構；表明擠壓溫度對蛋白質的二級結構影響顯著。有研究同時發(fā)現(xiàn)不同水分條件下所得擠出物的二級結構基本沒有變化，表明水分含量對蛋白質的二級結構影響較?。?0］。陳鋒亮［17］以紅外光譜對不同擠壓溫度（140、150、160℃）和含水量（28%～60%）條件下大豆分離蛋白擠出物的二級結構研究后也有類似發(fā)現(xiàn)，即擠壓溫度對α－螺旋和β－轉角的含量具有顯著的負影響，對β－折疊的含量具有顯著的正影響，而對無規(guī)則卷曲結構的含量沒有顯著影響。物料水分對蛋白質各二級結構的變化影響較小。但物料水分與擠壓溫度存在顯著的交互作用，并對β－轉角的含量產(chǎn)生極顯著負影響。

擠壓過程中，機械剪切對蛋白質的二級結構也有一定影響。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，系統(tǒng)研究了螺桿轉速對蛋白質二級結構的影響。結果表明，當螺桿轉速由60 r／min升高至180 r／min時，大豆蛋白β－折疊質量分數(shù)由55．6%降低至46．7%，而β－轉角質量分數(shù)由44．4%升高至53．5%。

可見，擠壓過程中蛋白質二級結構的變化受擠壓溫度影響較大。當溫度高于某一臨界值時，蛋白質的有序二級結構開始完全喪失。此臨界值的高低因擠壓原料的不同而存在較大差異。對于植物蛋白，此臨界溫度高于180℃。水分含量對二級結構的變化沒有顯著影響。螺桿轉速對β－折疊具有負影響，而對β－轉角具有正影響。

4 結論

螺桿擠壓后，原料中的主要蛋白質組分含量顯著降低，殘渣蛋白含量顯著增加。擠壓后，蛋白質亞基的分子質量分布呈現(xiàn)出向小分子質量轉變的趨勢。

擠壓過程中沒有異肽鍵的形成。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負影響，對自由巰基含量具有正影響。當擠壓溫度大于160℃時，溫度對自由巰基和二硫鍵含量的影響更明顯。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負影響。

擠壓會導致蛋白質的α－螺旋、β－轉角等有序二級結構含量降低。當擠壓溫度低于180℃時，植物蛋白不會完全轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結構。水分含量對蛋白質二級結構的變化沒有顯著影響。螺桿轉速對β－折疊具有負影響，對β－轉角具有正影響。

［1］Camire M E．Protein functionality modification by extrusion cooking［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，1991，68（3）：200－205

［2］Ledward DA，Tester R F．Molecular transformations of proteinaceous foods during extrusion processing［J］．Trends in Food Science and Technology，1994，5（4）：117－120

［3］王洪武，周建國，林炳鑒．新型雙螺桿食品擠壓機加工復合組織蛋白的研究［J］．農(nóng)業(yè)機械學報，2001，32（2）：66－69

［4］Tolstoguzov V B．Thermoplastic extrusion－the mechanism of the formation of extrudate structure and properties［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，1993，70（4）：417－424

［5］Manski J M，Van Der Goot A J，Boom R M．Advances in structure formation of anisotropic protein－rich foods through novel processing concepts［J］．Trends in Food Science and Technology，2007，18：546－557

［6］Akdogan H．High moisture food extrusion［J］．International Journal of Food Science＆Technology，1999，34：195－207

［7］Sheard P R，Ledward D A，Mitchell J R．Role of carbohydrates in soya extrusion［J］．Journal of Food Technology，1984，19：475－483

［8］OsborneT B．The vegetable proteins，2nd edn［M］．Longman－Green，London，1924

［9］Gujska E，Khan K．High temperature extrusion effects on protein solubility and distribution in navy and pinto beans［J］．Journal of Food Science，1991，56（4）：1013－1016

［10］Alonso R，Orúe E，Zabalza M J，et al．Effect of extrusion cooking on structure and functional properties of pea and kidney bean proteins［J］．Journal of the Science of Food and Agricuture，2000，80（3）：397－403

［11］Li M，Lee T C．Effect of extrusion temperature on solubilityand molecular weight distribution of wheat flour proteins［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44（3）：763－768

［12］Fischer T．Effect of extrusion cooking on protein modification in wheat flour［J］，European Food Research and Technology．2004，218（2）：128－132

［13］Anderson A K，Ng P．K．W．Changes in disulfide and sulfhydryl contents and electrophoretic patterns of extruded wheat flour proteins［J］．Cereal Chemistry，2000，77（3）：354－359

［14］Strecker T D，Cavalieri R P，Zollars R L，et al．Polymerization and mechanical degradation kinetics of gluten and glutenin at extruder melt－section temperatures and shear rates［J］．Journal of Food Science，1995，60（3）：532－537

［15］梅樂和，曹毅，姚善涇，等．蛋白質化學與蛋白質工程基礎［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2011，37

［16］Chiang A．Protein－protein interaction of soy protein isolate from extrusion processing［D］．Thesis of Missouri－Columbia University，Columbia，2007

［17］陳鋒亮．植物蛋白擠壓組織化過程中水分的作用［D］．北京：中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工所，2010

［18］徐樹來．擠壓加工對米糠主要營養(yǎng)成分影響的研究［J］，中國糧油學報，2007，22（3）：12－16

［19］魏益民，康立寧，張汆．食品擠壓理論與技術（中卷）［M］．北京：中國輕工業(yè)出版社，2009：86

［20］Burgess L D，Stanley D W．A possible mechanism for thermal texturization of soybean protein［J］．Canadian Institute of Food Science and Technology Journal，1975，9（4）：228－230

［21］Hager D F．Effects of extrusion upon soy concentrate solubility［J］，Journal of Agricultural and Food Chemistry，1984，32（2）：293－296

［22］Prudêncio－Ferreira SH，Arêas J A G．Protein－protein interactions in the extrusion of soya at various temperatures and moisture contents［J］．Journal of Food Science，1993，58（2）：378－381

［23］Lin S，Huff H E，Hsieh F－H．Texture and chemical characteristics of soy protein meat analog extruded at high moisture［J］．Journal of Food Science，2000，65（2）：264－269

［24］Liu K S，Hsieh F－H．Protein－protein interactions in high moisture－extruded meat analogs and heat－induced soy protein gels［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，2007，84（8）：741－748

［25］Chen F L，Wei Y M，Zhang B．Chemical cross－linking and molecular aggregation of soybean protein during extrusion cooking at low and high moisture content［J］．LWT－Food Science and Technology，2011，44：957－962．

［26］Jung S，Mahfuz A，Maurer D．Structure，protein interactions and in vitro protease accessibility of extruded and pressurized full－fat soybean flakes［J］．Journal of the American Oil Chemists’Society，2009，86：475－483

［27］張汆．花生蛋白擠壓組織化技術及其機理研究［D］．楊凌：西北農(nóng)林科技大學食品學院，2007

［28］Qi PX，Onwulata C I．Physical properties，molecular structures，and protein quality of texturized whey protein isolate：effect of extrusion temperature［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：4668－4675

［29］Rebello C A，Schaich K M．Extrusion chemistry of wheat flour proteins：II．sulfhydryl－disulfide content and protein structural changes［J］．Journal of Cereal Chemistry，1999，76（5）：756－763

［30］Creighton T E，Zapun A，Darby N J．Mechanisms and catalysts of disulphide bond formation in proteins［J］．Tibtech January，1995，13：18－23

［31］Visschers R W，de Jongh H H J．Disulphide bond formation in food protein aggregation and gelation［J］．Biotechnology Advances，2005，23：75－80

［32］闞建全．食品化學［M］．北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2002：53－54

［33］Yuryev V P，Zasypkin D V，Alexeyev V V，et al．Structure of protein texturates obtained by thermoplastic extrusion［J］．Molecular Nutrition and Food Research，1990，34（7）：607－613

［34］Qi P X，Onwulata C I．Physical properties，molecular structures，and protein quality of texturized whey protein isolate：Effect of extrusion moisture content［J］．Journal of Dairy Science，2011，94（5）：2231－2244．