北京軍區(qū)總醫(yī)院 檢驗科，北京 100700

VITEK II全自動微生物分析系統(tǒng)應(yīng)用問題分析

劉杰，趙滿倉，周海峰

北京軍區(qū)總醫(yī)院 檢驗科，北京 100700

本文闡述了 VITEK II全自動微生物鑒定系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)、工作原理及主要功能，并對其應(yīng)用中常見問題進(jìn)行了分析，結(jié)合實際提出了相應(yīng)解決方法。

全自動微生物分析系統(tǒng)；概率百分比；細(xì)菌鑒定；藥敏試驗卡

目前微生物的鑒定技術(shù)已逐步由手工走向自動化，法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK-Ⅱ是當(dāng)今常用的全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)自動化程度高、軟件功能多，檢測時特異性高、敏感性強、重復(fù)性好，且操作簡便、檢測速度快，絕大多數(shù)細(xì)菌的鑒定在2～18 h內(nèi)就能得出準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，已被廣泛地應(yīng)用于各大醫(yī)院和防疫領(lǐng)域。

1 VITEK- II全自動微生物鑒定系統(tǒng)

1.1 基本結(jié)構(gòu)

VITEK II的結(jié)構(gòu)組成：① 裝載艙（BOAT）：用于運送載卡架，關(guān)閉儀器外門，即可自動完成核對、稀釋、填充、切割、封閉及上卡、卸卡等操作；② 充液倉：調(diào)整菌懸液濃度，根據(jù)不同的細(xì)菌選擇相應(yīng)的鑒定卡和藥敏試驗卡片，將待測菌的菌懸液通過負(fù)壓充入卡內(nèi)；③ 封口器：利用高溫切割將卡片封口；④ 孵育箱/讀取器/退卡裝置：卡片在置孵育箱／讀數(shù)器中孵育，自動定時測試卡內(nèi)培養(yǎng)基中的生長變化值，讀取數(shù)據(jù)和判斷結(jié)果；判讀結(jié)束后，卡片處理儀器自動移除完成測試的卡片，可以降低錯誤取卡率；⑤ 計算機主機/顯示器/鍵盤/打印機，用于資料的儲存和分析、系統(tǒng)的操作、結(jié)果的分析鑒定，報告的自動顯示和打印；⑥ VITEK II 比濁計：測量待檢菌液的McFarland范圍，其中GN卡（用于革蘭氏陰性菌的測定）和GP卡（用于革蘭氏陽性菌的測定）的范圍是0.5～0.63，YST卡（用于絕大多數(shù)酵母菌及酵母樣真菌的測定）的范圍是1.8～2.2；⑦ SCS聰明工作站（Smart Carrier Station, SCS）：用于完成資料的初步輸入，采用預(yù)稀釋方式的實驗室則較少使用該結(jié)構(gòu)。

1.2 工作原理

VITEK II的生化鑒定根據(jù)不同種類微生物的理化性質(zhì)，以每種細(xì)菌的微量生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，使用64孔的反應(yīng)卡片，采用光電比色法，對微生物分解底物導(dǎo)致pH改變而產(chǎn)生的不同顏色進(jìn)行測定，來判斷反應(yīng)的結(jié)果。由計算機控制讀數(shù)器，每隔1 h對各反應(yīng)孔底物進(jìn)行光掃描，并讀數(shù)一次，動態(tài)觀察反應(yīng)變化。一旦鑒定卡內(nèi)的終點指示孔到達(dá)臨界值，則代表此卡已完成鑒定。最后一次讀數(shù)后，系統(tǒng)將所得的生物數(shù)據(jù)與菌種數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)菌的生物模型相比較，經(jīng)計算后，得出相似系統(tǒng)鑒定值（%Id），即機會率。VITEK II的藥敏測定采用64孔卡，每隔15 min用660 nm波長在16個位置各讀取3次透光率，與對照孔對比分析，根據(jù)生長曲線用動力學(xué)法計算最小抑菌濃度（Minimal InhibitoryConcentration, MIC）。同時VITEK II根據(jù)細(xì)菌耐藥規(guī)律而設(shè)定的專家系統(tǒng)可對結(jié)果進(jìn)行校正和修改。

1.3 概率百分比

在鑒定過程中，軟件會將每種細(xì)菌或某細(xì)菌群的試驗反應(yīng)與預(yù)期反應(yīng)相比較。概率百分比是一個由軟件計算的定量數(shù)值，表示每種細(xì)菌的試驗反應(yīng)與經(jīng)典反應(yīng)之間的相關(guān)程度。如果某種細(xì)菌或細(xì)菌群的試驗反應(yīng)模式和經(jīng)典反應(yīng)模式完美匹配，概率百分比將達(dá)到99%。如果不是完美的匹配，其反應(yīng)模式仍可能與預(yù)期反應(yīng)模式足夠接近，仍可明確鑒定細(xì)菌。鑒定可信概率百分比的范圍為85%～99%，數(shù)值越接近99%，表示該細(xì)菌越接近特定細(xì)菌的經(jīng)典模式。若待測菌不能夠在2～3種微生物間得到鑒別時，報告會給出一個匹配順序，表示其試驗反應(yīng)模式與所列經(jīng)典反應(yīng)模式之間可能存在的最佳匹配順序，但此順序并不表示試驗反應(yīng)與某種可能性的鑒定結(jié)果相匹配的模式明顯優(yōu)于另外一種模式。

2 VITEK-II系統(tǒng)的功能

系統(tǒng)可對包括各種腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵細(xì)菌、苛氧菌、革蘭陽性球菌、革蘭陰性球菌、厭氧菌和酵母菌在內(nèi)的500余種臨床病原菌進(jìn)行鑒定、藥敏等項目的測定。

（1）鑒定：預(yù)試驗只需要對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色即可。可快速鑒定定507種細(xì)菌（V2S 5.01版）：如GP卡（革蘭陽性菌鑒定卡）可鑒定包括葡萄球菌、腸球菌、草綠色和β溶血鏈球菌、棒狀桿菌屬以及李斯特氏菌屬和丹毒絲菌等在內(nèi)的116種細(xì)菌；GN卡（革蘭陰性桿菌鑒定卡）可鑒定包括腸桿菌科、弧菌科和非發(fā)酵菌（包括不動桿菌、氣單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、假單胞菌）等在內(nèi)的148種細(xì)菌；YST卡（酵母菌鑒定卡）可鑒定假絲酵母（念珠菌）、隱球菌、地霉、絲孢酵母、紅酵母等在內(nèi)的50種細(xì)菌；ANC卡（厭氧菌-棒狀桿菌鑒定卡）可鑒定包括放線菌、擬桿菌、梭桿菌、乳桿菌、真桿菌、梭菌、消化鏈球菌等在內(nèi)的63種細(xì)菌；BCL卡(革蘭氏陽性需氧芽孢桿菌鑒定卡)可鑒定40種芽胞桿菌；NH卡（奈瑟菌-嗜血桿菌鑒定卡）可鑒定包括奈瑟氏菌、嗜血桿菌、金氏菌、摩拉氏菌、布蘭漢氏菌等在內(nèi)的26種細(xì)菌；CBC卡（棒狀桿菌鑒定卡）可鑒定包括棒狀桿菌、乳桿菌及紅球菌等在內(nèi)的64種細(xì)菌。

檢測卡為一次性消耗品，每張檢測卡對應(yīng)接種1份標(biāo)本。該系統(tǒng)鑒定大腸埃希氏菌只需4 h就可得出鑒定結(jié)果，而傳統(tǒng)方法要在24 h后得出結(jié)果。且該系統(tǒng)由儀器自動讀數(shù)、比色、處理數(shù)據(jù)、打印結(jié)果，避免了人工判斷誤差。

（2）藥敏測定：分AST-GN革蘭陰性桿菌藥敏卡、AST-GP革蘭陽性球菌藥敏卡、AST-ST鏈球菌藥敏卡、AST-YS酵母菌藥敏卡以及多種藥物組合的藥敏卡，可同時進(jìn)行20種抗生素的藥敏試驗。

（3）高級專家系統(tǒng)（AES）功能：將不同專家的知識、經(jīng)驗匯集在一起編寫成的計算機軟件，是建立在MIC基礎(chǔ)上，綜合了微生物、藥理、臨床等多學(xué)科知識，具備CLSI（美國）和CASFM(歐洲)兩種判讀指南的多能專家系統(tǒng)，其對測試結(jié)果的審核能夠確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)主要功能有：① 能確認(rèn)鑒定及藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性；② 可檢出每菌株擁有的1種或多種耐藥表型；③ 可根據(jù)耐藥表型提示200種耐藥機理，2000種耐藥表型，及20000個MIC分布圖；④ 可根據(jù)CLSI或其他指南或權(quán)威文獻(xiàn)對藥敏結(jié)果提出修改建議；⑤ 可推測沒有測試的抗生素藥敏結(jié)果；⑥ 在病人報告中依照臨床特點提出有針對性的用藥指引。

3 VITEK-II結(jié)果說明

3.1 鑒定結(jié)果

（1）一般僅給出單一結(jié)果，無需進(jìn)行補充試驗，電腦主機VITEK 2 程序瀏覽結(jié)果時，可見結(jié)果可信度評估。單一良好結(jié)果可直接傳輸?shù)讲∪速Y料數(shù)據(jù)庫（LSN）和中文軟件中（在打開demoless模式設(shè)置并保證中文軟件通訊端口打開情況下），并可長期儲存。

（2）給出兩個及兩個以上結(jié)果，如某些細(xì)菌菌種可能會出現(xiàn)相似細(xì)菌的（混合）分類群鑒定結(jié)果，當(dāng)所列分類群的生化譜相同時會出現(xiàn)這種情況。儀器會提示進(jìn)行補充試驗以區(qū)分相似細(xì)菌的分類群，可判定相似細(xì)菌或低分辨率鑒定結(jié)果，選擇正確的鑒定結(jié)果，并將結(jié)果傳輸?shù)絃SN中。

（3）不能鑒定或無法確定的結(jié)果，提示查找原始分離平板，確認(rèn)所分離細(xì)菌是否為純培養(yǎng)，必要時重新分離細(xì)菌并重新進(jìn)行鑒定試驗。如果某特定鑒定模式是未被認(rèn)可的模式，會列出一個可能細(xì)菌的列表，否則就會確定菌株不在數(shù)據(jù)庫范圍內(nèi)。

注意某些分類群的相關(guān)注釋，如白喉棒狀桿菌是重要的病原體，鑒定結(jié)果可能對病人或標(biāo)本有臨床意義且結(jié)果需要審核。

3.2 藥敏結(jié)果

（1）如果同時進(jìn)行鑒定和藥敏試驗，細(xì)菌鑒定結(jié)果會自動加到藥敏卡上；否則需手工添加細(xì)菌名稱到藥敏卡上。

（2）如果有專家系統(tǒng)評語出現(xiàn)，則應(yīng)按操作規(guī)程對藥敏結(jié)果作適當(dāng)?shù)男薷牟⒋_認(rèn)最終結(jié)果。

（3）如果有瀏覽信息出現(xiàn)，應(yīng)按程序處理瀏覽信息并確認(rèn)最終結(jié)果。

（4）上述步驟處理完畢，結(jié)果會自動傳輸?shù)絃SN數(shù)據(jù)庫中。

（5）對于專家系統(tǒng)提示的不可能的或極少見的耐藥表型應(yīng)予以充分重視，需采用確認(rèn)試驗重新鑒定，如對萬古霉素耐藥的金黃色葡萄球菌、對泰能耐藥的腸桿菌、對青霉素耐藥的β溶血性鏈球菌等。

4 常見的問題及對策

4.1 沒有充分生長

（1）陰性結(jié)果（生化譜）的情況：① 如果兩次讀數(shù)的間隔時間相差40 min以上，報告“卡片錯誤-丟失數(shù)據(jù)”；② 提示“細(xì)菌的生化譜反應(yīng)性低-請確認(rèn)是否為活菌”，可用無菌注射器從生長對照孔或葡萄糖反應(yīng)孔吸出樣品0.1 mL接種血瓊脂于5%～10% CO2中于35 ℃培養(yǎng)18～24 h，判定是否為活菌；③ 如果某未知細(xì)菌的卡片結(jié)果是完全陰性或低反應(yīng)性，計算生化譜時結(jié)果將顯示為“無反應(yīng)或低反應(yīng)生化譜”。如出現(xiàn)以上問題只有重新進(jìn)行試驗。

（2）卡片填充不當(dāng)：上機前，菌株的革蘭氏染色必須準(zhǔn)確，否則可能上錯卡。其他的前處理，包括凝固酶、觸酶、氧化酶等的手工操作要規(guī)范，保證附加試劑不過期，才能正確判斷陰陽性，保證儀器正確選擇卡片。同時還要注意各種卡片本身是否合格、是否過期等。如出現(xiàn)該類問題只有重新進(jìn)行試驗。

4.2 不能鑒定細(xì)菌

（1）待檢菌不是單一菌株。首先每株細(xì)菌標(biāo)本都要進(jìn)行純培養(yǎng)后方可進(jìn)行鑒定；其次是操作過程中的污染，如混懸液(稀釋用鹽水）、吸頭、加樣槍等的污染會造成菌液不純。必須經(jīng)常更換稀釋用鹽水，每周把稀釋用加樣器用高壓鍋消毒一次（121 ℃，15 min）。

（2）反應(yīng)卡充液不完全。在配菌懸液時量要加足，才能排除懸液吸空時引入氣泡造成部分小孔未充入菌液，而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

（3）菌液濃度不準(zhǔn)確，菌液濃度太淡或太濃?；臼怯捎诒葷醿x長時間未進(jìn)行校準(zhǔn)，造成濁度不準(zhǔn)。必須經(jīng)常用標(biāo)準(zhǔn)管校準(zhǔn)儀器，同時在比濁時，要先調(diào)零，才能保證濁度的準(zhǔn)確性。

（4）菌齡不在對數(shù)生長期。一般純培養(yǎng)的菌株，18～24 h為最佳，質(zhì)控菌要反復(fù)傳代2～3次才能上卡片，盡量使菌群位于對數(shù)生長期。

（5）菌懸液不易乳化。像一些鏈球菌和棒狀桿菌，由于在鹽水中不易乳化，造成細(xì)菌分布不均勻，使得儀器不能對其鑒定?？稍谂渲茟乙簳r，加大濁度，再進(jìn)行鑒定。

（6）數(shù)據(jù)庫缺乏罕見生物新種或不典型菌株的資料。如假結(jié)核棒狀桿菌、麥?zhǔn)习魻顥U菌、產(chǎn)粘棒狀桿菌、杰氏棒狀桿菌、密歇根棍狀桿菌等細(xì)菌，其試驗結(jié)果位于非典型或處于未鑒定區(qū)域，這是因為數(shù)據(jù)庫缺乏相關(guān)資料造成的。可通過傳統(tǒng)分類法，參照雙歧檢索表，對菌株進(jìn)行鑒定；也可選擇其他鑒定方法，如VITEK-MS；還可參照其他公司鑒定儀的細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。

（7）光學(xué)系統(tǒng)未校正。讀數(shù)儀光學(xué)讀數(shù)頭出現(xiàn)問題，需要定期校準(zhǔn)。

4.3 鑒定評論信息

在結(jié)果中有時會出現(xiàn)如“好的可信性但難于區(qū)分”(Good Confidence，Marginal Separation)的鑒定評論信息，即生化反應(yīng)結(jié)果同時相似于數(shù)據(jù)庫中兩種菌群，且產(chǎn)生可接受的絕對相似值，需加做一些試驗方可確定其鑒定結(jié)果。

5 討論

1970年，法國梅里埃推出API微生物鑒定條，API徹底改革了細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域。傳統(tǒng)的微生物鑒定方法至今仍存在操作復(fù)雜，不易判讀的缺點。API使得細(xì)菌的鑒定變得快速和可靠。全球微生物學(xué)家均在使用簡單而高性能的API系統(tǒng)，使之迅速成為細(xì)菌鑒定的國際金標(biāo)準(zhǔn)。API/ID 32是目前涵蓋范圍最廣的細(xì)菌鑒定系列，包括15種鑒定系統(tǒng)，涵蓋了微生物實驗室可能會遇到的所有細(xì)菌種屬如葡萄球菌（API Staph）、腸桿菌科（API 20E）、非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌（API 20NE）等。但是API畢竟是個手工系統(tǒng)，因此梅里埃公司有研發(fā)了VITEK 系列全自動微生物鑒測儀[1-3]。

VITEK II[4-5]及其同系列VITEK 2 COMPACT[6]鑒定儀是目前在微生物檢驗中使用率較高的全自動微生物鑒測儀。VITEK II鑒定法與傳統(tǒng)鑒定法相比，具有功能多、速度快、中間環(huán)節(jié)少、結(jié)果準(zhǔn)確、自動化程度高等優(yōu)點。但VITEK II鑒定法也有它的局限性，如VITEK-Ⅱ數(shù)據(jù)庫資料的不完整將直接影響鑒定的準(zhǔn)確性。迄今為止，尚無一個鑒定系統(tǒng)能涵蓋所有的細(xì)菌鑒定資料，因此微生物的鑒定也仍以傳統(tǒng)的手工鑒定方法API為“金標(biāo)準(zhǔn)” 。

在日常工作中，要得到正確的鑒定結(jié)果，技術(shù)人員的素質(zhì)和經(jīng)驗很重要，應(yīng)對技術(shù)人員進(jìn)行手工鑒定基礎(chǔ)與操作技能培訓(xùn)，如革蘭氏染色,形態(tài)學(xué)的觀察、填卡前的預(yù)處理等。此外，隨著人們對細(xì)菌本質(zhì)認(rèn)識的加深，細(xì)菌的分類系統(tǒng)不斷演變，應(yīng)及時按照CLSI新標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行更新?？傊?，不斷提高操作人員的操作能力與綜合素質(zhì)，及時更新儀器數(shù)據(jù)庫，遇到問題及時與廠家聯(lián)系，才能不斷提高臨床微生物鑒定和藥敏結(jié)果的準(zhǔn)確性[7]。

[1] 郭民,孟偉．VITEK微生物分析系統(tǒng)的應(yīng)用研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志,2007,19(2):226-228．

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[3] 毛彩萍,周國明．兩種儀器在微生物室間質(zhì)評中的應(yīng)用與比較[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2006,16(10):1195-119．

[4] 段純,朱巖,李素麗,等．兒童患者血培養(yǎng)分離人蒼白桿菌耐藥性分析[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21(3):606-607．

[5] 林曉梅,周鐵麗,李超．副流感嗜血桿菌生物分型與方法評價[J]．江西醫(yī)學(xué)檢驗,2002,20(2):87-88．

[6] 喬寧,喻華,殷琳,等．VITEK 2 COMPACT全自動微生物分析儀性能分析[J]． 淮海醫(yī)藥,2012,30(3):211-213．

[7] 馮念倫,孫鐵軍,劉文蘭．全自動微生物鑒定和藥敏分析儀器的解析及應(yīng)用[J]．醫(yī)療設(shè)備信息,2006,21(11):91-93．

Analysis of Application Problems of VITEK II Automatic Microbe Identification System

LIU Jie, ZHAO Man-cang, ZHOU Hai-feng
Department of Laboratory, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

This paper discussed the basic structures, working principles and main functions of VITEK II automatic microbe identification system, and analyzed the common application problems of the system to find the corresponding solutions based on practices.

automatic microbe identification system; percentage probability; bacteria identification; test cards of drug susceptibility

TH776

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2013.09.045

1674-1633(2013)09-0119-03

2013-03-25

作者郵箱：fhalj1@yahoo．cn