周立強 沈關(guān)心 (華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院免疫學系，武漢430030)

在干細胞的不對稱分裂中，母細胞分裂成為具有不同命運的兩個子細胞[1]。在這個過程中，關(guān)鍵的命運決定因子定位在分裂細胞的一極，并引起兩個子細胞獲得不同數(shù)量的關(guān)鍵決定因子。在果蠅(Drosophila)的神經(jīng)元干細胞中，轉(zhuǎn)錄因子Prospero作為終末分化和自我更新的開關(guān)[1]。

而在效應T細胞和記憶T細胞的命運決定中，也發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[2-5]。遺傳證據(jù)提示，T 盒轉(zhuǎn)錄因子(T-box transcription factor，T-bet)，在激活的初始CD8+T細胞中是一個關(guān)鍵的命運決定因子，能促使初始CD8+T細胞分化成為效應T細胞，而抑制初始CD8+T細胞向記憶T細胞轉(zhuǎn)變[2]。在激活的初始CD4+T細胞中，T-bet促進初始CD4+T細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)變，而抑制初始CD4+T細胞向Th2和Th12細胞群轉(zhuǎn)變[6]。這些因子在數(shù)量上的小變化將顯著影響T細胞的命運[2-5]。上述結(jié)果提示，這些關(guān)鍵因子的不對稱分離，能決定T細胞命運。

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解途徑的簡介

泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomal system，UPS)由包括泛素(Ubiquitin)、泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzymes，E1)、泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes，E2)、泛素連接酶(Ubiquitin ligases，E3)、蛋白酶體(Proteasomes)和去泛素化酶(Deubiquitinases，Dub)在內(nèi)的至少6個組分組成。泛素是這個系統(tǒng)的中心，在E1、E2和E3的作用下能與需降解的靶蛋白相結(jié)合，并且能被Dub 從靶蛋白上解除[7]。

泛素僅僅在真核生物中被發(fā)現(xiàn)，在大部分組織中表達，且高度保守。泛素通過泛素化的方式來調(diào)節(jié)其靶蛋白，從而參與細胞的活動過程[7]。理論上，蛋白中任何賴氨酸殘基均能被泛素鏈接，包括泛素自身。而泛素化靶蛋白生物功能的不同，取決于泛素化類型。

泛素化可分為三種類型[8]:①單泛素化(Monoubiquitination);②多次泛素化(Multiubiquitination or polymonoubiquitination):蛋白被多次單泛素化;③多泛素化(Polyubiquitination):蛋白被多泛素鏈所結(jié)合。不同的泛素化類型調(diào)節(jié)不同的細胞過程，包括蛋白降解、信號轉(zhuǎn)導、跨膜運輸、DNA修復、染色體重塑(Chromatin remodeling)、過氧化物酶體的生物合成(Peroxisome biogenesis)和病毒發(fā)芽(Viral budding)。例如在泛素的第11位賴氨酸(11th lysine，K11)和第48位賴氨酸(48th lysine，K48)的多泛素化主要參與蛋白降解[8]。

泛素化過程，也稱為泛素化級聯(lián)反應(Ubiquitination cascade)，是一個ATP依賴的酶催化反應，需要至少三種類型的酶，包括 E1、E2和 E3[9]。泛素通過E1使用ATP作為能量的來源形成泛素-腺苷中間體(Ubiquitin-adenylate intermediate)而被激活。接著，泛素被轉(zhuǎn)移到E1活化位點(半胱氨酸殘基)，而引起形成泛素的羰基C-末端和E1的半胱氨酸巰基之間的硫酯鍵。隨后，激活的泛素通過反式(硫代)酯化反應[trans(thio)esterification reaction]從E1轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸活化位點上。最后，能識別靶蛋白的特異識別分子的E3，通過與E2和底物相互作用，使得靶蛋白的賴氨酸和泛素的甘氨酸C-末端之間形成異肽鍵(Isopeptide bond)[10]。

在人類的基因組中，有兩個基因編碼E1，60～100 個基因編碼 E2s，1000 多個基因編碼 E3s[7]。這些酶形成一個等級結(jié)構(gòu)，控制整個泛素化過程。在泛素化級聯(lián)反應中，E1能結(jié)合幾十個E2s，E2s又能結(jié)合上百個E3s，E3s特異性結(jié)合上千個靶蛋白[10]。

蛋白酶體是一個分子量超過2000道爾頓，由一個20S的核心顆粒和兩個19S的調(diào)節(jié)顆粒組成的26S的桶狀大蛋白復合體。蛋白的K48或者K11被多泛素化后，將在桶狀蛋白內(nèi)水解[8]。

Fuentealba等[11]最近研究發(fā)現(xiàn)，在細胞分裂時，泛素化的待降解蛋白被一個子細胞所遺傳。在分裂的人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫組化染色可見，在80% ～90%的有絲分裂中，不同位點的多泛素化的同一種蛋白是不對稱分離的，提示這種不對稱分離可能導致子細胞的不同命運。Narimatsu等[12]發(fā)現(xiàn)，E3參與了細胞的不對稱分裂過程。Chang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的不對稱分離參與了一種T細胞命運決定因子的不對稱分離的過程，從而導致T細胞的不同命運。這些結(jié)果提示，UPS可能通過引起T細胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的不對稱分離，從而引起 T細胞不對稱分裂的命運。

2 蛋白酶體不對稱分離與T細胞命運決定

2.1 蛋白酶體不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 2011年，Chang等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，在激活的初始T細胞進行分裂過程中，T-bet在子細胞之間發(fā)生不對稱分離。并且，T-bet的不對稱性調(diào)節(jié)機制與有絲分裂過程中蛋白酶體依賴的降解機制的不對稱分布有關(guān)。蛋白酶體的定位與T-bet相反，以至于獲得少量蛋白酶體的子細胞獲得更多的T-bet。T-bet的不對稱性能通過抑制蛋白酶體依賴的降解而被阻止，表明T-bet和蛋白酶體的不對稱分布相關(guān)。在有絲分裂過程中，抑制蛋白酶體的不對稱分離，可阻止T-bet的不對稱分離。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體的不對稱分離，引起有絲分裂過程中決定因子的不對稱降解，使得關(guān)鍵決定因子不對稱分類進入兩子細胞。

蛋白酶體的不對稱分離引起T-bet在母細胞分裂過程中的不對稱分離，導致T-bet在子細胞中的數(shù)量上的異常，從而將導致子細胞的不同命運。遺傳獲得T-bet多的初始CD8+T細胞分化為效應T細胞，而獲得T-bet少的細胞則向記憶T細胞轉(zhuǎn)變;遺傳獲得T-bet多的初始CD4+T細胞分化為Th1細胞，而獲得T-bet少的細胞則向Th2和Th12細胞轉(zhuǎn)變。

2.2 參與蛋白酶體不對稱分離的機制 Chang等[13]的研究提示，酪氨酸激酶ITK可能是一個關(guān)鍵信號。ITK參與T細胞受體結(jié)合的下游事件，并對T細胞的發(fā)展和分化途徑起作用[14]。目前的研究提示ITK的另一作用是在有絲分裂的過程中，使得T-bet被蛋白酶體依賴的降解途經(jīng)所降解。在ITK缺陷的T細胞，將使得T-bet的不對稱分離的現(xiàn)象不存在，并且不能使T-bet進入遠端的子細胞(The distal daughter cell)，干擾子細胞的能力而變成記憶細胞。這些結(jié)果提示ITK在CD8+記憶細胞發(fā)育中的起作用[15]。在CD4+T細胞也是相似的。ITK缺陷導致T-bet不對稱性消失，向Th2細胞轉(zhuǎn)化減少。這與在ITK缺陷的小鼠中觀察到Th2細胞分化障礙的結(jié)果一致[16]。

3 泛素化蛋白的不對稱分離與子細胞

3.1 泛素化蛋白的不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 自從1882年Flemming描述了有絲分裂后，對于體細胞分裂的研究集中在細胞物質(zhì)的均等分離上，特別是染色體和參與有絲分裂的細胞器[17]。而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，許多有絲分裂是不均等的，比如待蛋白酶體降解的泛素化蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)誘發(fā)的Smad1信號能被復雜的UPS降解途徑所調(diào)節(jié)[11]。Smad1在被BMP受體(BMP receptor，BMPR)進行C-末端磷酸化而激活后，被MAPK(Mitogen-activated protein kinases)和糖原合酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3，GSK3)在其連接區(qū)域連續(xù)磷酸化。MAPK和GSK3的磷酸化對于Smad1的多泛素化和降解是必要的[18]。Fuentealba等[11]使用針對第214位絲氨酸(Ser-214，pS-mad1MAPK)和第210位絲氨酸(Ser-210，pSmad1GSK3)的磷酸化特異性抗體(potent phospho-specific antibodies)追蹤細胞內(nèi)Smad1蛋白的定位，發(fā)現(xiàn)Smad1蛋白被特異性降解。在分裂的人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)免疫組化染色顯示，在80%～90%的有絲分裂中，pSmad1MAPK和pS-mad1GSK3是不對稱分裂的，而總的Smad1是均勻的。這種現(xiàn)象是意想不到的，因為hESCs的自我更新的分裂一直被認為是對稱分裂[19]。同樣使用Cos7細胞，pSmad1MAPK、pSmad1GSK3、被 GSK3 磷酸化的 β-連環(huán)蛋白、所有多泛素化的蛋白也是不對稱分裂的。這種不對稱分布至少連續(xù)保持三代。泛素化蛋白的不對稱性也發(fā)生在體內(nèi)，因為在胚盤階段的果蠅(Drosophila)胚胎中，MAPK磷酸化的Mad臨近兩個中心體的一個，提示體內(nèi)的不對稱現(xiàn)象。

3.2 泛素化蛋白不對稱分離的機制 眾所周知，中心體能確保細胞進行均等的有絲分裂，并由兩個被基質(zhì)蛋白(matrix of proteins)[例如γ-微管蛋白和中心粒周圍蛋白(Pericentrin)]所形成的微管組織中心[microtubule-organizing center(MTOC)]所包圍的小中心粒組成[17]。最近研究發(fā)現(xiàn)，中心體還在細胞中擔當?shù)鞍姿庵行牡慕巧?，用蛋白酶體抑制劑處理哺乳動物細胞群中，未降解蛋白積累，并引起中心體周圍物質(zhì)(Peripheral centrosomal material)顯著增多[20]。蛋白酶體集中在許多細胞群的中心體[21]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，需降解的泛素化Smad1定位在Cos7細胞的中心體區(qū)域[18]。

中心粒是半保留式復制[17]，在大部分分裂間期，中心體或微管輻射的細胞中心仍優(yōu)先與母中心粒相關(guān)[22]。在干細胞分化過程中，不對稱細胞分裂已經(jīng)被證實[23]。在一些情況下，母中心體在不對稱分裂過程中與干細胞相關(guān)[11]。因此，中心體周圍物質(zhì)的不對稱遺傳影響干細胞分化的結(jié)果。

Fuentealba等人[11]推測在中心粒分裂時的中心體周圍蛋白不對稱遺傳并在G2/M轉(zhuǎn)換時遷移到細胞的另一極。在G2/M期，中心粒分離而中心體周圍物質(zhì)仍保留在一極。而這種不對稱分布是為了讓中心體周圍物質(zhì)被一個子細胞所遺傳。

3.3 泛素化蛋白不對稱分離的意義 從功能的觀點來看，待降解的泛素化蛋白的不對稱分裂使得只有一個子代細胞被遺傳這些蛋白，而這對于那些難降解蛋白是非常有意義的，并與帕金森病、阿爾海默病和亨廷頓病相關(guān)[24]。有可能，積累太多的難降解蛋白的增殖細胞會凋亡。因此，分裂的細胞群進行這種生理機制在細胞分裂時清除自身需降解的蛋白。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，損傷的羰基化蛋白質(zhì)選擇性的保留在母細胞中而沒有被出芽所遺傳，而這可能是維持新生細胞健康的機制[25]。相似的，擁有蛋白質(zhì)折疊疾病(Protein folding disease)神經(jīng)退行性脊髓小腦共濟失調(diào)3型(Neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 3)的腸隱窩(Intestinal crypts)患者在分化的隱窩細胞而不是干細胞中積累聚集體[24]。

而海洋蝸牛Ilyanassa obsoleta特異性mRNA(編碼調(diào)節(jié)蛋白，例如Tolloid和Dpp)的降解與一個子中心體相關(guān)，這證實了不對稱細胞命運決定的機制[26]。在線蟲和環(huán)節(jié)動物胚胎的降解過程中，這種細胞機制也參與了核β-連環(huán)蛋白的不對稱分離[27]，提示這種蛋白降解機制可能參與細胞的不對稱的命運，并可能參與T細胞不對稱分裂的過程。

4 泛素連接酶不對稱分離與子細胞

4.1 泛素連接酶不對稱分離的發(fā)現(xiàn) 平面細胞極性(Planar cell polarity，PCP)的研究發(fā)現(xiàn)一組核心進化上保守的蛋白[包括 Van Gogh/Strabismus(Vang/Stbm or Vangl)，F(xiàn)lamingo/Starry night/Cadherin EGF LAG seven-pass G-type receptor(Fmi/Stan/Celsr)，F(xiàn)rizzled(Fz/Fzd)，Dishevelled(Dsh/Dvl)，Prickle(Pk)，Diego/Diversin]在其中起重要作用[28]。并且在大鼠的耳蝸毛細胞中，Celsr1，Vangl2，Dvl1/2和 Fz3/6的突變能破壞靜纖毛的方向[29]。重要的是，這些突變展示了嚴重的神經(jīng)管缺陷和縮短的前后側(cè)(Anterior-posterior，AP)軸，伴隨著擴張的內(nèi)外側(cè)軸[29]。許多研究發(fā)現(xiàn) PCP蛋白(例如 Dvl、Pk、Vangl和 Diego)是不對稱分布的[30]。在果蠅的翅膀中，無論是近端的(Proximal)Vang和Pk，還是遠端位于細胞表面的Fz、Dvl和Diego，這些PCP組分形成離散的蛋白復合體。這種PCP蛋白不對稱分布的機制仍不清楚。

Smad泛素化調(diào)節(jié)因子-1(Smad ubiquitination regulatory factor-1，Smurf1)和 Smurf2與 C2-WWHECT類的E3泛素連接蛋白相關(guān)，而C2-WW-HECT類的E3泛素連接蛋白在調(diào)節(jié)細胞信號，細胞極性和細胞運動性中起重要作用[31]。特別是Smurf是極性蛋白Par6的效應因子，通過使RhoA降解調(diào)節(jié)細胞運動性和極性[32]，并且在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[epithelial-to-mesenchymal transition(EMT)]過程中，Smurf向Par6以TGFβ依賴的方式招募，來使緊密連接解離[33]。Narimatsu 等[12]發(fā)現(xiàn)在大鼠 Smurf1和Smurf2的突變將導致PCP的收斂和伸展運動(Convergence and extension movements，CE)消失，并且Par6-Dvl-Smurf復合體在細胞中是不對稱分布的，并與Dvl、Vangl和Pk分布相反。這些研究結(jié)果提示，Smurf泛素連接酶在非經(jīng)典的Wnt途徑中起作用，通過調(diào)節(jié)核心PCP信號途徑的組分，引起這些關(guān)鍵的細胞極性因子的不對稱分布。

4.2 泛素連接酶不對稱分離的機制 蔬菜中的PCP被非經(jīng)典的Wnt信號和一系列核心的PCP途徑組分所調(diào)節(jié)。Narimatsu等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，Smurf在哺乳動物中是PCP信號的一個組分，證明Smurf通過Dvl被招募到Par6的非經(jīng)典的Wnt信號途徑調(diào)節(jié)PCP途徑的組分的降解，控制PCP途徑的組分Pk1的不對稱分布。這種被Smurf泛素連接酶調(diào)節(jié)的PCP組分的不對稱分布，在調(diào)節(jié)細胞運動和細胞極性上，起重要作用。并且這種機制的存在提示，泛素連接酶的不對稱分布可能在調(diào)節(jié)細胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子引起細胞分裂后的子細胞命運決定中起重要作用。這種可能同樣會發(fā)生在T細胞中。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，UPS系統(tǒng)在細胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白因子的不對稱分布中起關(guān)鍵作用，并且提示其對細胞不對稱分裂后細胞命運決定的作用。蛋白酶體的不對稱分布通過影響T細胞命運關(guān)鍵決定因子的不對稱分布，而決定T細胞的命運。提示UPS系統(tǒng)可能參與T細胞的命運過程。而泛素化蛋白的不對稱分布對細胞命運的影響，泛素連接酶對細胞內(nèi)關(guān)鍵因子的不對稱分布的影響，都從不同角度提示了UPS對細胞不對稱分裂的影響。UPS的不同機制可能參與決定T細胞不同命運。隨著UPS對T細胞命運決定的影響的研究，將有助于更深入對T細胞分化的理解，對整個免疫反應的理解，從而對臨床上許多免疫相關(guān)疾病的治療提供新的策略。

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