曹 巖 申葉春 張 凡 常永霞 張 斌 (張家口市第一醫(yī)院口腔科，河北 張家口 075000)

實體腫瘤的浸潤生長和轉(zhuǎn)移均需要血管生成，腫瘤新生血管密度是評估患者轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要指標(biāo)，而新生血管內(nèi)皮主要的標(biāo)記物為CD105。血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)是目前所知作用最強的血管生長因子，在腫瘤血管形成過程中起重要作用，并與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān);轉(zhuǎn)移抑制基因nm23是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，腫瘤組織該基因的表達降低是實體瘤浸潤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。VEGF-C和nm23在口腔鱗癌中的表達與微血管密度(MVD)及其口腔鱗癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系目前尚不明確。本文探討口腔鱗癌VEGF-C、nm23和內(nèi)皮細胞CD105表達，與局部血管生成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1992～2006年行手術(shù)切除治療的口腔鱗癌患者的存檔蠟塊68例，標(biāo)本均經(jīng)病理證實。所有患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，均有完整的臨床病理資料。年齡23～74(平均41.35)歲。有頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。另選擇正常口腔黏膜標(biāo)本16例作為對照。

1.2 試劑與方法 試劑:兔抗人VEGF-C多克隆抗體、鼠抗人nm23單克隆抗體和鼠抗人CD105單克隆抗體(均為工作液)SP免疫組化超敏染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑等均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。3氨基-9-乙基-卡唑(AEC)染色劑購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。采用免疫組織化學(xué)SP法，實驗操作按試劑盒說明。VEGF-C和nm23用DAB顯色，用試劑公司提供的陽性片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替第一抗體作為陰性對照。CD105單克隆FITC標(biāo)記抗體采用美國B-D公司產(chǎn)品。流式細胞術(shù)主要步驟:新鮮標(biāo)本用眼科剪刀粉碎后PBS漂洗，800 r/min離心3 min，2次，70%冷乙醇固定，4℃冰箱過夜，300目尼龍篩網(wǎng)過濾，再用PBS調(diào)整細胞濃度至1×106/ml。PBS洗去乙醇，加入FITC標(biāo)記的熒光抗體，4℃避光孵育30 min，PBS漂洗利用美國B-D公司生產(chǎn)的Facscalibur型流式細胞儀，以波長635 nm、輸出功率為15 W的氬離子激光器作光源檢測分析10 000個細胞。

1.3 結(jié)果判定 VEGF-C和nm23均主要為胞質(zhì)著色，少數(shù)為胞核著色，以胞質(zhì)/胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為陽性染色細胞，判定標(biāo)準(zhǔn)為:以陽性細胞率＞25%為陽性表達(+)，陽性細胞率≤25%為陰性表達(－)。CD105陽性率:陽性細胞大于50%為陽性，小于20%為陰性，20% ～50%之間為可疑陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行χ2、t檢驗和等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF-C和nm23在口腔鱗癌和正常上皮中的表達VEGF-C、nm23在口腔鱗癌組織中的陽性表達率分別為52.94%和48.52%，前者明顯高于正常組織(30.27%)(P＜0.01)，而后者低于正常組織(66.95%)(P＜0.05)。

2.2 VEGF-C和nm23表達與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌組織中VEGF-C陽性表達率(79.82%)顯著高于無轉(zhuǎn)移的組織(25.69%)(P＜0.01)，而在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中nm23的表達(35.88%)明顯低于無轉(zhuǎn)移的組織(61.03%)(P＜0.05)。

2.3 CD105陽性率 CD105在正常上皮中呈現(xiàn)陰性表達，而在口腔鱗癌中呈現(xiàn)陽性表達(84.17%)，且腫瘤中央陽性率明顯高于腫瘤周邊(P＜0.01)。

2.4 VEGF-C和nm23表達與CD105陽性率的關(guān)系 VEGF-C陽性表達的口腔鱗癌CD105陽性率(91.22%)明顯高于其陰性表達組(77.29%)(P＜0.05)，且兩者之間存在密切相關(guān)(r=0.863 7，P＜0.01)，nm23陽、陰性表達的口腔鱗癌中CD105陽性率分別為74.17%和86.08%。差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，兩者之間不存在直線相關(guān)(r=－0.157 7，P＞0.05)。

2.5 VEGF-C和nm23表達的相關(guān)性分析 相關(guān)分析結(jié)果顯示，VEGF-C表達與 nm23表達呈負(fù)相關(guān)(r=－0.525，P＜0.01)，即VEGF-C陽性表達率較高者nm23陽性表達率較低，VEGF-C陽性表達率較低者nm23陽性表達率則較高。

3 討論

腫瘤的浸潤發(fā)展與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的臨床生物學(xué)特性之一，直接導(dǎo)致口腔鱗癌臨床分期滯后，甚至喪失手術(shù)機會，是影響口腔鱗癌預(yù)后的主要因素之一。近年來研究表明，腫瘤誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)與腫瘤的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

VEGF-C為目前已知的作用最強的促血管生成因子，在腫瘤血管形成中起重要作用。VEGF-C是VEGF家族的新成員，它是一種針對淋巴管內(nèi)皮細胞的有絲分裂原，雙重轉(zhuǎn)基因小鼠實驗證明，VEGF-C能誘導(dǎo)淋巴管生成，并介導(dǎo)腫瘤細胞播散和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移〔1～3〕。VEGF-C和受體VEGF-R3結(jié)合后，通過MEK/ERK和PI3激酶/Akt途徑引起淋巴管內(nèi)皮增生，并可能改變原有的和新生的淋巴管內(nèi)皮的通透性以及腫瘤細胞和胞外基質(zhì)的黏附性;同時淋巴管數(shù)目增多，使瘤細胞接觸淋巴管的機會增多，也促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。近年來發(fā)現(xiàn)VEGF-C及VEGF-R3與頭頸部腫瘤、胃癌、大腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤的淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且是獨立的預(yù)后不良因素。本研究結(jié)果提示VEGF-C可能參與口腔鱗癌的發(fā)生過程。VEGF-C陽性表達率較高的口腔鱗癌組織有較強的侵襲和穿越淋巴管的能力，其陽性表達可能與口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和進展有關(guān)。

CD105基因位于人染色體9q34，其蛋白是一種同型二聚體的膜結(jié)合糖蛋白，分子量為180 kD，是轉(zhuǎn)化生長因子受體復(fù)合物的成分之一，其功能是參與血管生成。CD105是一種內(nèi)皮細胞標(biāo)志物，僅在處于增殖狀態(tài)的腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞上而在正常的組織血管上無表達〔4～6〕。本實驗提示VEGF-C在促進口腔鱗癌微血管形成中起一定作用;同時，腫瘤中央部位微血管密度較高，而中央部位由于缺氧導(dǎo)致的壞死也比較嚴(yán)重，可能是刺激VEGF-C合成的主要因素，當(dāng)腫瘤生長到一定體積時，因宿主血管生成不足，而引起局部缺氧，從而刺激腫瘤細胞分泌VEGF-C，促進新生血管生成，增加血管通透性。因此，VEGF-C一方面加速了腫瘤的生長，另一方面促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

已知人類的nm23基因家族有8個成員，nm23基因編碼產(chǎn)物是核苷二磷酸激酶，它通過調(diào)節(jié)GTP的合成參與G蛋白調(diào)控的跨膜信息傳遞，從而對細胞的分化及癌基因的轉(zhuǎn)化起作用，此外研究顯示尚有激發(fā)管蛋白聚合的作用，因此具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力，與抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的是 nm23-H1〔7～9〕。nm23-H1編碼一個相對分子質(zhì)量為18×103的二磷酸核苷激酶，與腫瘤的遠程轉(zhuǎn)移有關(guān)，其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制仍不清楚。nm23基因與口腔鱗癌的關(guān)系，目前這方面的研究較少，且得出的結(jié)果有很大的不一致性，有報道〔8〕認(rèn)為nm23基因只與宮頸腺癌的預(yù)后有關(guān)而與宮頸鱗癌無關(guān)。有學(xué)者〔9〕對乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中nm23表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，說明nm23基因在腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移過程中起重要的抑制作用。本研究提示nm23基因的失活與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。nm23基因突變、低表達具有促進腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。nm23基因的表達對微血管生成及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能具有協(xié)同作用。本研究提示nm23低表達可能促進VEGF-C高表達，從而促使癌間質(zhì)血管新生，為腫瘤的浸潤進展提供氧和營養(yǎng)物質(zhì);在口腔鱗癌細胞分化、轉(zhuǎn)移和臨床進展過程中，VEGF-C與nm23之間可能具有相互誘導(dǎo)或信息傳遞的負(fù)調(diào)節(jié)作用。

1 Kasten P，Beyen I，Egermann MR.Instant stem cell therapy:characterization and concentration of human mesenchymal stem cells in vitro〔J〕.Eur Cell Mater，2008;23(16):47-55.

2 Jo CH，Kim OS，Park EY.Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion〔J〕.Cell Tissue Res，2008;334(3):423-33.

3 Jiang A，Hu W，Meng H.Loss of VLDL receptor activates retinal vascular endothelial cells and promotes angiogenesis〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009;50(2):844-50.

4 Ishimura D，Yamamoto N，Tajima K.Differentiation of adipose-derived stromal vascular fraction culture cells into chondrocytes using the method of cell sorting with a mesenchymal stem cell marker〔J〕.Tohoku J Exp Med，2008;216(2):149-56.

5 Han K，Lee JE，Kwon SJ.Human amnion-derived mesenchymal stem cells are a potential source for uterine stem cell therapy〔J〕.Cell Prolif，2008;41(5):709-25.

6 Perdikogianni C，Dimitriou H，Stiakaki E.Could cord blood be a source of mesenchymal stromal cells for clinical use〔J〕?Cytotherapy，2008;10(5):452-9.

7 Erdbruegger U，Grossheim M，Haubitz M.Diagnostic role of endothelial microparticles in vasculitis〔J〕.Rheumatology，2008;47(12):1820-5.

8 Benetti A，Berenzi A，Gambarotti M.Transforming growth factor-beta1 and CD105 promote the migration of hepatocellular carcinoma-derived endothelium〔J〕.Cancer Res，2008;68(20):8626-34.

9 Ahmadvand D，Rasaee MJ，Rahbarizadeh F.Production and characterization of a high-affinity nanobody against human endoglin〔J〕.Hybridoma(Larchmt)，2008;27(5):353-60.