馬曉峰董樂樂

(1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙 包頭 014010)

人羊膜的研究進展

馬曉峰1董樂樂2

(1 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙 包頭 014010；2 包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙 包頭 014010)

通過大量查閱國內(nèi)外有關(guān)人羊膜的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究文獻并總結(jié)這些研究成果?？梢匀肆私庋蚰さ膩碓磸V，價格低、與細胞相容性好、抗原性低，羊膜上皮層具有上皮細胞及成纖維細胞生長因子等多種細胞生長因子，而基底膜含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ等多種類型膠原、纖維橋接蛋白及多種糖蛋白，由于這些結(jié)構(gòu)的特殊性，使其能夠促進多種細胞的生長。近年來隨著組織工程生物工程對羊膜的進一步研究，人羊膜在臨床中的應(yīng)用會更加被重視。

人羊膜；基礎(chǔ)；組織工程；臨床應(yīng)用

人羊膜作為一種生物材料，在基礎(chǔ)研究及臨床中的應(yīng)用已有很多年的歷史。1910年，Davis用胎膜作為手術(shù)替代材料進行皮膚移植，并取得成功。1913年，Stem和Sabella分別報導(dǎo)了用羊膜來治療皮膚燒傷和皮膚潰瘍[1-3]。隨后羊膜被應(yīng)用于各種手術(shù)，包括：眼科、顱腦外科、腹腔外科和婦科等。隨著對人羊膜的的進一步研究，隨著組織工程及生物工程的發(fā)展，人羊膜在臨床中的應(yīng)用會越來越廣泛。

1 概 述

1.1 羊膜的結(jié)構(gòu)和功能

羊膜位于胎兒絨毛膜的表面，從細胞滋養(yǎng)層衍生而來，是光滑、無神經(jīng)、無血管、無淋巴的雙層透明膜，厚0.02～0.05mm，是人體最厚的基底膜[4-6]。羊膜由5層機構(gòu)構(gòu)成：羊膜上皮，基底膜，致密層，成纖維細胞層，海綿層[7，8]。每層結(jié)構(gòu)都有其獨特的作用，并且含有多種生長因子，這些生長因子主要由羊膜上皮細胞分泌[9]。主要包括：生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α、肝細胞生長因子、角化細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子1、2[10]。組織學(xué)及電鏡觀察證實，胚胎早期的羊膜具有和胎兒皮膚相似的組織結(jié)構(gòu)，從而認為羊膜具有和皮膚相同的屏障和防御保護功能。運用于創(chuàng)面的修復(fù)能起到保護創(chuàng)面不受到細菌等微生物侵入，減少感染的作用。一般情況下，β3-防御素是細菌細胞壁中的肽聚糖或脂多糖對羊膜上皮形成刺激而產(chǎn)生的。防御素是一類內(nèi)源性抗菌肽，它具有很廣泛的抗微生物活性，對革蘭陽性、陰性細菌、真菌及薄膜病毒的殺傷作用很強。所以認為羊膜具有天然免疫性[11]。羊膜的上皮細胞還具有潛在的分化能力，因為已經(jīng)有研究證實鼠羊膜上皮在特定生化條件下不僅分化為毛囊上皮細胞，而且還可以分化為皮膚[12]。此外，羊膜基底膜中存在大量富含硫酸乙酰肝素的蛋白多糖，可以起到與皮膚相似的屏障作用，使羊膜成為半通透膜。

1.2 常用羊膜的特點以及類型

在對羊膜進行臨床研究以及基礎(chǔ)研究的過程中，羊膜細胞外基質(zhì)、凍存羊膜以及新鮮羊膜是最常用的羊膜材料，它們的特點各不相同，且制備方法有所不同。凍存羊膜和羊膜外基質(zhì)首先需要制備新鮮羊膜。新鮮羊膜在制備過程中保留了羊膜上皮細胞及各種細胞因子，有利于眼表的重建，故用來治療眼表疾病。然而因為新鮮羊膜含有細胞成分，所以有輕微抗原性，且保存時間不長，使用起來不太方便。與新鮮羊膜比較，凍存羊膜能夠保存較久，使用起來要方便很多。所謂的羊膜外基質(zhì)主要是指除去可溶性蛋白以及細胞，僅保留原組織中不能被溶解的成分，此類不可溶解的成分主要有結(jié)構(gòu)蛋白、氨基葡聚糖、彈性蛋白、膠原蛋白等，將此類物質(zhì)作為細胞的生長支架，不僅有利于細胞的黏附，而且保存時間長，方便使用[5]。

1.3 羊膜的制備

按照供體醫(yī)學(xué)標準，必須嚴格檢查捐贈者的身體狀況，通過血清學(xué)檢測保證其未受乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，巨細胞病毒和梅毒螺旋體的感染，捐贈者無產(chǎn)道感染淋球菌或衣原體病史，無其他傳染性疾病和惡性腫瘤。

1.3.1 新鮮羊膜的制備：新鮮羊膜的制備有多種方法。在這里介紹一種常用方法：將羊膜取下，清洗，去血污，然后置入0.5%胰酶中消化（一塊羊膜約300mL），37℃，30min～1h，中間稍加攪拌，消化以羊膜的蛻膜層能脫落為準。消化后的羊膜直接放入1mol/L碳酸氫鈉中浸泡（200mL），4℃，20h，時間過長會影響質(zhì)量，此時的羊膜應(yīng)該是潔白而且是半透明，雙蒸水反復(fù)沖洗至pH至7～8左右，置入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，每天液體要更換一次，1周左右就可用于下一步實驗。

1.3.2 制備凍存羊膜[4]：將制備好的羊膜放入4℃的純甘油中進行脫水處理，每隔24h對甘油液體進行1次更換，液體的更換次數(shù)總共為3次。完成上述工序后，將其放入4℃恒溫冰箱中保存?zhèn)溆?。將?jīng)過脫水處理的羊膜取出，放入到含有硫酸軟骨素的DMEM液與純甘油的混合液（其比例為1∶1）中浸泡，-80℃超低溫冰箱儲存，6個月備用。

1.3.3 羊膜細胞外基質(zhì)的制備：將經(jīng)甘油脫水后的羊膜取出，PBS液水化，加入0.25%胰蛋白酶，37℃室溫下消化，再用細胞刮子刮除殘存的羊膜上皮細胞，于倒置相差顯微鏡下，證實無細胞后羊膜上皮面朝上平鋪于乙酸纖維薄膜紙上，加入含硫酸軟骨素的100%甘油∶DMEM液(1∶1)中浸泡，置于4℃恒溫冰箱儲存，1周備用，或-80℃超低溫儲存，6個月備用。有研究者將生理鹽水漂洗后的羊膜用0.2%戊二醛交聯(lián)，0.5%十二烷基磺酸鈉、0.25%胰酶脫細胞，反復(fù)漂洗，冷凍干燥，分裝密封，環(huán)氧乙烷消毒備用。

2 臨床應(yīng)用

2.1 眼科：羊膜的臨床應(yīng)用比較廣泛，目前眼科應(yīng)用較多。眼科主要用羊膜行結(jié)膜疾病導(dǎo)致的結(jié)膜缺損、角膜疾病致角膜缺損的移植。Gris等[9]報道了用凍干羊膜治療眼科疾病的長期隨訪研究，其結(jié)果表明，在對眼表疾病進行治療的過程中，羊膜具有較高的安全性，特別是對于結(jié)膜切除術(shù)后結(jié)膜缺損的患者，尤為實用。

2.2 燒傷整形科：近年羊膜廣泛的運用于燒傷患者的皮膚缺損的覆蓋與修復(fù)。廣西省梧州市紅十字會醫(yī)院燒傷整形外科陳燕圖、黃仁勝等[6]對102例燒傷患者應(yīng)用羊膜敷料覆蓋213個創(chuàng)面的臨床治療后，療效確切滿意。主要表現(xiàn)為疼痛減輕，創(chuàng)面滲出減少，全身性反應(yīng)輕，創(chuàng)面愈合時間縮短。羊膜覆蓋后，膜下很少積液，減少了創(chuàng)面感染的因素。

2.3 除了在眼科于燒傷整形科得應(yīng)用外，近年不少學(xué)者在骨外科嘗試運用羊膜治療疾病。如肌腱斷裂、神經(jīng)損傷，而且在這些方面也做了很多基礎(chǔ)研究。羅靜聰?shù)萚8]在實驗中將肌腱切斷，重新縫合后用人脫細胞羊膜包裹，與對側(cè)不用羊膜的肌腱比較，雖然未發(fā)現(xiàn)羊膜對肌腱愈合有影響，但證實羊膜能有效減少肌腱粘連。MLigiliche等[7]將脫細胞羊膜制成管狀誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生.隨著對羊膜研究的進一步深入，我們相信羊膜的應(yīng)用會更加廣泛的應(yīng)用于臨床，為更多患者帶來福音。

[1] 梁婧.人羊膜對創(chuàng)面愈合的促進作用[J].中國美容醫(yī)學(xué),2009,1(18): 131-133.

[2] Gris O.Amniotic membrane transplantation for ocular surface pathology: long-term results [J].Transplant Proc,2003,35(5):2031-2035.

[3] Dua HS.The amniotic membranein ophthalmology[J].SurvOphth almol,2004,49(1):51-77.

[4] 羅曉婷.新鮮制備及中長期保存的羊膜細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)特征[J].中國臨床康復(fù)雜志,2006,1(10):79-81.

[5] 范偉杰.羊膜的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究進展[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2006,20(1):65-68.

[6] 陳燕圖.羊膜敷料在燒傷創(chuàng)面的臨床應(yīng)用[J].華夏醫(yī)學(xué)雜志,2004, 1(17):44-45.

[7] Mligiliche N.Extracellular matrix of human amnion manufactured into tubes as conduits for peripheral nerve regeneration[J].J Biomed Mater Res,2002,63(5):591-600.

[8] 羅靜聰.脫細胞羊膜對鼠肌腱粘連的影響[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2004,18(5):431-436.

[9] Gris O.Amniotic mem-brane transplantation for ocular surface pathology: long-term results[J].Transplant Proc,2003,35(5): 2031-2035.

[10] Koizumi NJ.Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane[J].Curr Eye Res,2000,20(3): 173-177.

[11] Buhimschi IA.The novel antimicrobial peptide beta3-defensin is produced by the amnion: a possible role of the fetal membranes in innate immunity of the amniotic cavity[J].Am J Obstet Gyne col,2004,191(5):1678-1687.

[12] Fliniaux I.Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles[J].Differentiation,2004,72(9-10):558-565.

R329.2

A

1671-8194（2013）26-0051-02