張 汀，李 宗，陶 潔，廖金虎，朱國(guó)強(qiáng)，袁建設(shè)

（1.無(wú)錫檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 無(wú)錫 214101；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院畜禽病原微生物研究室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

電子束輻照技術(shù)是借助電子加速器產(chǎn)生的電子束射線對(duì)食品和農(nóng)產(chǎn)品中幼蟲、卵和微生物體的強(qiáng)激發(fā)和電離輻射作用，使活體生物內(nèi)部發(fā)生輻射化學(xué)和輻射生物學(xué)效應(yīng)，致使有機(jī)體生殖力受損或使其生命合成物化學(xué)鏈中斷，導(dǎo)致代謝功能紊亂，從而達(dá)到殺滅病毒、細(xì)菌和寄生蟲等目的[1]。該技術(shù)不僅具有殺滅病毒、細(xì)菌和寄生蟲作用，而且方便快捷，安全環(huán)保。

目前，電子束輻照主要應(yīng)用于食品保鮮，在解決食品安全問(wèn)題中具有獨(dú)特的技術(shù)特色和優(yōu)勢(shì)，特別是在防止食品中食源性致病微生物污染和進(jìn)出口檢疫方面存在著巨大的應(yīng)用潛力[2]。Luchsinger等[3]研究報(bào)道，利用電子束0～3.85 kGy輻照無(wú)骨豬肉，可以有效殺滅冷鮮肉中的大腸桿菌和沙門氏菌。電子束輻照效應(yīng)的研究證明其對(duì)食品中的食源性微生物污染和致病菌都有著非常好的殺滅效果，是保障食品質(zhì)量安全的有效技術(shù)手段，且在所用劑量范圍內(nèi)對(duì)食品品質(zhì)和加工特性影響甚微[4]。但目前還沒(méi)有利用電子束輻照技術(shù)殺滅病毒相關(guān)的研究報(bào)道。

本文重點(diǎn)論著電子束輻照技術(shù)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品中有代表性病毒活性的影響研究，本研究采用無(wú)錫愛邦集團(tuán)生產(chǎn)的電子10MeV直線電子加速器射線源，選用具有代表性的動(dòng)物有囊膜病毒—新城疫病毒、牛皰疹病毒1型；無(wú)囊膜病毒—雞傳染性法氏囊病毒進(jìn)行電子束輻照試驗(yàn)，初探其對(duì)動(dòng)物病毒活性的影響。

1 試驗(yàn)材料

新城疫（Newcastle disease，ND）病毒；傳染性法氏囊（infectious bursal disease，IBD）病毒和SPF雞胚，從揚(yáng)州威克有限公司購(gòu)買；MDBK細(xì)胞和BHV-1病毒Coloradol毒株（采用美國(guó)進(jìn)口材料，由美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Dr.Bello惠贈(zèng)，揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)組保存）。MDBK細(xì)胞采用DMEM（Gibco BRL）培養(yǎng)基和馬血清（Hyclone）培養(yǎng)。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、馬血清購(gòu)自Hyclone公司；0.25%胰酶購(gòu)自Gibco公司；25cm2細(xì)胞瓶、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞凍存管購(gòu)自Corning公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 雞胚接種[11]

2.1.1 絨毛尿囊腔內(nèi)接種 取9～11日齡SPF雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育情況，劃出氣室位置，用錐子在酒精燈火焰燒灼消毒后，在氣室交界處無(wú)血管處鉆一小孔，用1 mL注射器從小孔處插入，深約針頭的1/3長(zhǎng)度，注射量為0.1 mL。注射后以石蠟封閉小孔，置孵育箱中直立孵育，逐日觀察。

2.1.2 絨毛尿囊膜接種 取9～11日齡雞胚，先在照蛋燈下檢查雞胚發(fā)育情況，劃出氣室位置，并選擇絨尿膜發(fā)育區(qū)作一“記號(hào)”。將胚蛋橫臥于蛋座上，絨尿膜發(fā)育區(qū)“記號(hào)”朝上。用碘酒消毒記號(hào)處及氣室中心部，在氣室中心錐小孔。然后用錐子輕錐記號(hào)處蛋殼，約0.5 mm深，使其卵殼穿孔而殼膜不破。用洗耳球吸去氣室部空氣的同時(shí)，隨即因上面小孔進(jìn)入空氣而絨尿膜陷下形成一個(gè)人工氣室，天然氣室消失。接種時(shí)針頭與卵殼成直角。自上面小孔直刺破卵膜進(jìn)入人工氣室約3～5 mm，注入0.1 mL病料，正好在絨尿膜上。接種完畢用熔化石蠟封閉兩孔，人工氣室向上，橫臥于孵化箱中，逐日觀察。

2.1.3 1%雞紅細(xì)胞制備 先用滅菌注射器吸取3.8%枸櫞酸鈉溶液（其量為所需血量的1/5），從雞翅靜脈抽血至需要血量，置滅菌離心管內(nèi)，加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍，以2000 r/min離心10 min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅細(xì)胞洗滌三次，最后根據(jù)所需用量，用滅菌生理鹽水配成1%懸液。

2.2 血球凝集試驗(yàn)（HA）[12]

在96孔“V”形微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50 μL生理鹽水；于左側(cè)第1孔加50 μL病毒收獲液，混合均勻后，吸50 μL至第2孔，混合均勻后，吸50 μL至第3孔，依次倍比稀釋，至第11孔，吸棄50 μL，稀釋后病毒稀釋度為第1孔1:2，第2孔1:4，第3孔1:8……，最后1孔為對(duì)照；自左至右依次向各孔加1%雞紅細(xì)胞50 μL置微型混合器上振蕩1 min或以后固定轉(zhuǎn)圈振蕩反應(yīng)板，使血球和病毒充分混合，在37 ℃溫箱中作用15～30 min后，待對(duì)照紅細(xì)胞已沉淀可觀察結(jié)果；判定結(jié)果：以100%凝集（血球成顆粒性傘狀凝集沉于孔底）的病毒最大稀釋孔為該病毒血凝價(jià)，即一個(gè)凝集單位，不凝集者紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)[13]

MDBK細(xì)胞用含10%馬血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液顏色改變時(shí)換液，或者每隔2～3 d換液。換液時(shí)，先將舊培養(yǎng)液傾斜至瓶底一角，用吸管吸出，然后加入PBS溶液洗滌培養(yǎng)物，吸出PBS溶液后再加入新的培養(yǎng)液。封口后繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，就將其分瓶傳代，具體操作：先將舊培養(yǎng)液傾斜至瓶底一角，用吸管吸出，然后加入PBS溶液洗滌培養(yǎng)物，吸出PBS溶液后加入1 mL 0.25%胰酶，室溫消化，待細(xì)胞大部分都變圓時(shí)，用吸管將胰酶吸出，然后加入新的培養(yǎng)基，用吸管將貼壁的細(xì)胞吹下來(lái)，再補(bǔ)加部分培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 病毒的分離培養(yǎng)

將長(zhǎng)成單層的MDBK細(xì)胞消化，并鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。待MDBK細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液；并將BHV-1接種于單層MDBK細(xì)胞，吸附2 h；棄去細(xì)胞上清懸液，加入含2%馬血清的DMEM維持液，在37 ℃于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接毒后72 h內(nèi)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)96 h后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。將其在-20 ℃和室溫凍融3次后，4 ℃，10000 g離心10 min；取上清，盲傳3代后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。

2.5 NDV輻照方案

（1）NDV病毒用9～11日齡SPF雞胚傳代，該病毒應(yīng)在96 h內(nèi)致死雞胚。測(cè)定半數(shù)致死量（ELD50）和血凝效價(jià)，收集尿囊液分裝無(wú)菌青霉素小瓶中（玻璃瓶），-20 ℃保存。（2）準(zhǔn)備2個(gè)不同病毒滴度的NDV樣品（NDV弱毒苗原液，NDV弱毒苗10倍稀釋液），每個(gè)樣品各準(zhǔn)備3份，采用無(wú)錫愛邦電子加速器公司的10MeV電子加速器進(jìn)行靜態(tài)輻照加工，設(shè)0、10、20、30 kGy 4個(gè)不同吸收劑量水平。（3）將輻照處理后的樣品接種9～11日齡SPF雞胚尿囊腔，觀察雞胚有無(wú)死亡和病變，如果雞胚沒(méi)有死亡，則取雞胚尿囊液，測(cè)定其血凝價(jià)并解剖觀察雞胚有無(wú)病變。

2.6 IBDV輻照方案

（1）選擇9～11日齡SPF雞胚，將IBDV病毒液接種于SPF雞胚的絨毛尿囊膜。雞胚通常在感染后4～6 d死亡。在雞胚中連續(xù)3次傳代以后，收集尿囊液，并測(cè)定其半數(shù)致死量，分裝并存放于-20 ℃。（2）準(zhǔn)備2個(gè)不同滴度的病毒樣品（IBDV弱毒苗原液，IBDV弱毒苗10倍稀釋液），每個(gè)滴度各準(zhǔn)備3份，采用無(wú)錫愛邦電子加速器公司的10MeV電子加速器進(jìn)行靜態(tài)輻照加工，設(shè)0、10、20、30 kGy 4個(gè)不同吸收劑量水平。（3）將輻照處理后的樣品接種9～11日齡SPF雞胚，若雞胚死亡，則說(shuō)明該輻照方案無(wú)效；若雞胚沒(méi)有死亡，則收集雞胚尿囊液，盲傳3代后再判定結(jié)果。如果盲傳3代后，雞胚仍未發(fā)生死亡，則說(shuō)明該輻照殺毒方案有效。

2.7 BHV-1輻照具體方案

（1）BHV-1在牛腎繼代細(xì)胞（MDBK）上大量增殖擴(kuò)毒，收集病毒懸液并測(cè)定其病毒滴度（PFU），分裝并保存于-70 ℃。（2）準(zhǔn)備病毒樣品，共2份，每份各準(zhǔn)備3個(gè)重復(fù)樣品，采用無(wú)錫愛邦電子加速器公司的10MeV電子加速器進(jìn)行靜態(tài)輻照加工，設(shè)0、30 kGy 2個(gè)不同吸收劑量水平。（3）將輻照處理后的樣品接種MDBK細(xì)胞，首先觀察該病毒是否引起細(xì)胞病變；若沒(méi)有細(xì)胞病變，則收集感染細(xì)胞懸液并盲傳3代，觀察細(xì)胞病變情況。

3 結(jié)果

3.1 NDV輻照試驗(yàn)結(jié)果

10 kGy輻照劑量處理的NDV樣品尿囊腔接種雞胚后，均有死亡情況，解剖胚體有出血等病變，尿囊液血凝價(jià)均高于28；而接種20 kGy和30 kGy輻照處理的NDV樣品的雞胚均未出現(xiàn)死亡情況，解剖胚體無(wú)病變，尿囊液無(wú)血凝價(jià)。說(shuō)明30 kGy的輻照劑量就足以完全滅活NDV病毒。

3.2 IBDV 輻照試驗(yàn)結(jié)果

10 kGy和20 kGy輻照劑量處理的IBDV樣品絨毛尿囊膜接種雞胚后，均有死亡情況，解剖胚體有出血等病變；而接種30 kGy輻照處理的IBDV樣品的雞胚未出現(xiàn)死亡情況，解剖胚體無(wú)病變，盲傳3代后仍無(wú)死亡情況。說(shuō)明30 kGy的輻照劑量能完全滅活I(lǐng)BDV病毒。

3.3 BHV輻照試驗(yàn)結(jié)果

接種BHV 0 kGy處理樣品的MDBK細(xì)胞在48 h內(nèi)全部100%病變，而接種BHV 30 kGy處理樣品的MDBK細(xì)胞在5 d后仍未出現(xiàn)細(xì)胞病變。將接種BHV 30 kGy處理樣品的細(xì)胞收集起來(lái)，-40 ℃/室溫反復(fù)凍融3次后，再次接種MDBK細(xì)胞，盲傳3代，仍無(wú)細(xì)胞病變。說(shuō)明該輻照試驗(yàn)有效，30 kGy的輻照劑量能夠?qū)⑴＃é粒┌捳畈《綛HV-1 Coloradol完全滅活。

4 討論

本試驗(yàn)旨在通過(guò)不斷的探索研究，摸索利用電子束輻照技術(shù)能夠?qū)⒉《就耆珳缁畹妮椪談┝俊?/p>

本試驗(yàn)中，我們選擇了3種對(duì)外界環(huán)境耐受性較強(qiáng)的病毒，其中有2種是有囊膜病毒，即NDV和BHV-1，另一種是無(wú)囊膜病毒，即IBDV。我們選用了0 kGy、10 kG、20 kGy和30 kGy 4個(gè)不同輻照劑量來(lái)對(duì)ND、IBDV和BHV進(jìn)行輻照試驗(yàn)，輻照試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，10 kGy的輻照劑量不能滅活NDV和IBDV，而20 kGy的輻照劑量能夠?qū)DV完全滅活，但不能完全滅活I(lǐng)BDV。說(shuō)明無(wú)囊膜病毒的耐受性要比有囊膜病毒的耐受性更強(qiáng)一些。而30 kGy的輻照劑量能夠?qū)DV、IBDV和BHV-1完全滅活。

綜上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，電子束輻照技術(shù)可以很大程度的影響病毒活性，在一定輻照劑量下，能夠有效殺滅致病病毒。對(duì)動(dòng)物產(chǎn)品（含冷凍產(chǎn)品）相關(guān)病毒和食品中的食源性微生物污染和致病菌都有著非常好的殺滅效果，這在解決動(dòng)物產(chǎn)品、食品安全中的致病性微生物問(wèn)題中，具有獨(dú)特的技術(shù)特色和優(yōu)勢(shì)，是保障動(dòng)物產(chǎn)品、食品質(zhì)量安全的有效技術(shù)手段，且在所用劑量范圍內(nèi)對(duì)貨物品質(zhì)和加工特性影響甚微，在創(chuàng)導(dǎo)綠色、環(huán)保、安全的質(zhì)量控制要求下，電子束輻照技術(shù)應(yīng)用于食品安全、疫病疫情的控制將是發(fā)展的方向，特別在國(guó)境口岸開展檢驗(yàn)檢疫處理工作方面，有著巨大的應(yīng)用潛力和推廣價(jià)值。

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