王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026）

水果中有機酸的分析方法研究進展

王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026）

水果中常見的有機酸有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乙酸、丁二酸和草酸等，是果實中主要的風味營養(yǎng)物質，可軟化血管，促進鈣、鐵元素的吸收，能刺激消化腺的分泌活動，有增進食欲、幫助消化吸收及止渴解暑的功能，是果品成熟度、儲藏性以及加工性的重要依據(jù)，其種類和含量與果品品質有密切關系，因此研究水果中有機酸的組成和含量，在果品品質鑒定中占有重要地位[1,2]。由于有機酸種類較多，易溶于水或乙醇，難溶于其它的有機溶劑。目前，關于有機酸的提取和檢測方法較多，有水提取法[3～4]、衍生化法[5]、滴定法[6～7]、分光光度法[8]、GC[9～10]、HPLC/HPLC-MS[11～14]等，通過對這些方法的總結和對比，可更好的為不同水果中有機酸的分析方法研究提供參考依據(jù)。

1 樣品前處理方法

1.1 提取方法

有機酸主要是含有羧基(-COOH)、磺酸(-SO3H)、亞磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等一類的化合物，與水和強極性的溶劑有很好的溶解性，因此，大多數(shù)采用水和醇類提取。劉文靜等[15]稱取一定量的楊梅勻漿基質，加入蒸餾水旋渦振蕩2min，超聲提取15min處理；郭根和等[2]在枇杷果肉的勻漿液中加入一定量 0.04moL· L-1KHPO-HPO，pH為

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2.4 的緩沖液，75℃水浴加熱浸提45min，冷卻至室溫，旋渦振蕩2min，超聲提取15min，過濾；龐新安等[3]對巴旦杏、無花果、沙棗、石榴采用80%乙醇勻漿提取 5min處理，均取得較好的回收率；沈宏等[16]將番茄勻漿，加入適量的蒸餾水，在75℃水浴中提取15min；王瑞琪等[17]在煙草粉末中加入蒸餾水，壓力為10.3Mpa，溫度60℃，靜態(tài)時間6min，沖洗體積150%，吹掃時間100 s，靜態(tài)循環(huán) 1次的條件下加速溶劑萃取其中的有機酸。

1.2 凈化方法

對于不同的樣品要采取不同的凈化方法。目前使用最多的凈化方法為液液萃取和固相萃取兩種。郭燕等在測定蘋果中有機酸的過程中，經過蒸餾水超聲提取后，在10000r/min離心15min和過C18固相萃取小柱(先用2mL甲醇活化，再用5mL水洗去甲醇)，取 5mL試液，以10mL/min流速通過預活化的固相萃取小柱，棄去初始的 2mL濾液，收集后續(xù) 3mL濾液，用0.45 μ m濾膜過濾[4,18]，均有較好的回收率；高蕓等[5]有機酸衍生化反應后通過二氯甲烷液液分配凈化后，采用氣相色譜測定；藏祥韻等[19]將水果中的有機酸經過乙醇提取后，濾液通過DEAE纖維素交換柱(柱長20cm、內徑 1cm裝約15mL的DEAE纖維素)，先用50mL無離子水洗去糖分及其它雜質，再用70mL 0.1N Na2SO4溶液洗脫有機酸。

1.3 衍生化方法

有機酸難溶于有機溶劑，具有一定的酸性，為了能夠用于氣相色譜檢測，需要發(fā)生衍生化反應，生成沸點低，易于氣化的酯化

物質，但存在方法比較繁瑣，反應過程不充分等問題。曾有報道，獼猴桃樣品提取液中加入10%H2SO4-CH3OH溶液，低速機械振蕩30min，放置過夜進行衍生化反應[5,20]；杜曦等[21]測定了葡萄酒中的多元有機酸，樣品于蒸發(fā)皿中，用0.1mol/L的四甲基氫氧化銨中和至pH為8，水浴蒸干，冷至室溫，以N,N-二甲基甲酰胺分次溶解剩余有機酸鹽，溶液轉移入試管中，逐滴加入一定量碘乙烷，緊塞，搖勻，放置30min后在選定實驗條件下進樣分析。

2 測定方法

2.1 液相色譜(HPLC))方法

由于有機酸易溶于水，一般選擇液相色譜法進行檢測。有機酸大多數(shù)都有紫外吸收，故選用紫外檢測器，同時該類化合物在C18柱上面都能取得較好的分離效果，選取不同的流動相可以滿足不同的需求。劉文靜[15]等對楊梅果實中的10種有機酸進行液相色譜測定，流動相：0.04mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液，pH值2.4；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；進樣量10uL；檢測波長：214nm，得到有效分離；黃桂穎等[22]測定了荔枝肉中草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸10種有機酸，采用0.01mol/L（NH4）2HPO4（pH 3.0）溶液作為流動相，流速為1.00mL/ min，檢測波長為213nm；陳向明等在流動相為3%甲醇- 0.01mol/L K2HPO4溶液，用磷酸調節(jié) pH為2.0，流速為0.5mL/min，進檢測波長為210nm的條件下測定銀杏果中7種有機酸的含量，檢出限在 0.001～ 0.067 μg/mL之間；另外一種采用離子排斥色譜法測定水果中的有機酸，其為高容量的樹脂，電離組分受排斥不被保留，而弱酸則有一定保留的原理，即分離機理為離子排斥。郭燕等[4]采用光電二極管陣列檢測器測定蘋果中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等幾種有機酸，檢測波長為210nm，流動相為0.01mol/L H2SO4溶液，流速為 0.5mL/min，色譜柱為ICPAKTMION Exclusion(WAT010290)，取得較好的分析效果；郭德華等[23]采用離子排斥色譜法同時測定果汁中11種有機酸，流動相也為 H2SO4。

2.2 液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS))分析法

液相色譜-質譜聯(lián)機是使用合適的接口技術將液相色譜和質譜儀聯(lián)結起來的一種大型儀器，不僅檢測靈敏度高、選擇性好，并且可以定性、定量檢測同時進行，對于初級監(jiān)測呈陽性反映的樣品進行在線確證，優(yōu)勢十分明顯。

王乃平等采用液質聯(lián)用法測定廣山楂有機酸含量色譜柱為Kinetex HILIC100 A ( 4.60 mm×100 mm，2.6 μm)，流動相為乙腈-乙酸銨水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min，進樣量 0.5 μ L，質譜條件為ESI離子源，檢測方式為MRM多重反應監(jiān)測，負離子模式，干燥氣溫度35℃，霧化器壓力40Psi，干燥氣流速10L/min，掃描方式選擇離子監(jiān)測(SIM)，結果顯示，蘋果酸、檸檬酸、酒石酸 3種有機酸回收率分別為103.07%(RSD 3.85%)，99.51% (RSD 4.12%)，85.03%(RSD 4.39%)。

2.3 氣相色譜（GC）方法

氣相色譜法(GC法)是采用氣體作流動相，待測組分通過色譜柱，利用物質在兩相中的反復分配，最后實現(xiàn)組分的分離和檢測，它分析的對象是氣體以及可揮發(fā)的物質。常用的色譜柱有填充柱、毛細管柱兩大類，檢測器一般有ECD、FPD、FID、NPD、TCD等。

對于有機酸酯化后的衍生物，其中主要集中在FID的檢測[5,21,24]，高蕓等對獼猴桃中的有機酸進行衍生化后，采用氣相色譜法測定，在DB- 5毛細管柱，進樣口溫度250℃，檢測器溫度280℃，升溫程序：初始溫度40℃，保持 2min，以8℃/min升至250℃，保持 6min的色譜條件下取得良好的分離和較高的回收率。

2.4 氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS))分析法

GC-MS聯(lián)用儀分析農藥最初是以電子轟擊離子定性，選擇離子檢測定量開始的，當高靈敏度的離子阱質譜儀出現(xiàn)以后，GC-CI-MS方法已成為農藥殘留分析的常規(guī)手段。氣質聯(lián)用技術既發(fā)揮了色譜法的高分離能力，又發(fā)揮了質譜法的高鑒別能力，尤其適用于多殘留分析，現(xiàn)已經成為一種相對成熟的檢測手段。

目前對于有機酸的檢測大多采用EI源[20,25]，如梁茂雨等采用此方法測定紅提葡萄中有機酸，樣品經過硫酸甲醇酯化后，選取彈性石英毛細管柱HP-Innowax，程序升溫：初溫 50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃，保持15min。 進樣口溫度250℃，進樣量1.0 μ L，分流比10∶1，氦氣流速1mL/ min；EI源電子能量70Ev,電子倍增器電壓1600 V，質量掃描范圍30AMU～550 AMU，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，可測得17種有機酸。

3 結語

果實中有機酸是決定果實風味品質的重要因素之一。對有機酸成分檢測技術的不斷更新能夠更好地為有機酸在水果中的調控提供更準確的數(shù)據(jù)，它在果實自身代謝中參與了光合作用、呼吸作用，以及合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質的代謝過程。通過有機酸成分檢測方法的分析和評述，為有機酸方面的研究提供更好的依據(jù)。

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