程云環(huán)，滕井通，薛建平，張愛(ài)民,盛 瑋

（1.淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院；2.淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

山藥零余子為薯蕷科多年生藤本植物薯蕷(Dioscorea opposita Thunb.)葉腋間的珠芽[1]，俗稱(chēng)“山藥蛋”，呈卵圓形或橢圓形，直徑在0.4-2.0cm之間，外表呈淡黃色，頂端中間略有莖痕，質(zhì)堅(jiān)硬，斷面灰白色至灰褐色，氣味淡而不苦，口嚼黏膩.主要含有淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、多種游離氨基酸，膽堿、尿囊素、植酸、多種維生素、淀粉酶、山藥素等物質(zhì)[2].自古就是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的滋補(bǔ)食品和藥用價(jià)值很好的藥材，但因其體積小、商品價(jià)值不高，每年除少量作種用外，大部分都被白白扔掉[3].

多酚是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、防曬美白、護(hù)肝益腎、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多種生理功能[4].論文以懷山藥及其零余子為供試材料，提取多酚物質(zhì)并進(jìn)行含量測(cè)定、比較分析，為懷山藥零余子進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

懷山藥(Dioscorea opposita Thunb.)及其零余子采集于河南省溫縣，經(jīng)淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院薛建平教授鑒定為薯蕷科薯蕷屬懷山藥及其零余子.將懷山藥及其零余子用流動(dòng)水沖洗，除去附著在表面的泥沙，然后將懷山藥（切成片狀）和零余子放入電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃烘干至恒重，將烘干后的懷山藥和零余子粉碎放入干燥器中備用.

1.2 主要儀器

SHH·W21·420三用電熱恒溫水浴鍋 北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司生產(chǎn)；CP213電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；FDV超微粉碎機(jī) 北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司生產(chǎn)；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn).

1.3 主要試劑

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 生工生物工程（上海）有限公司產(chǎn)品；1N Folin-Ciocalteu試劑（FC試劑） 上海荔達(dá)生物科技有限公司產(chǎn)品；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.4 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的沒(méi)食子酸0.0500g，用超純水溶解并定容至100mL，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.精密量取1.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于50mL容量瓶中加超純水定容至50mL，搖勻，即得濃度為10μg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，置于冰箱中保存?zhèn)溆?

1.5 懷山藥及其零余子樣品溶液的制備

精密稱(chēng)取粉碎并干燥至恒重的懷山藥及其零余子樣品各10.0000g，分別裝入圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇200mL，搖勻，在70℃水浴中回流提取2h，真空抽濾，洗滌殘?jiān)?次，合并洗滌液.將乙醇提取液減壓濃縮至無(wú)乙醇?xì)馕叮谜麴s水將濃縮物溶解并定容至50mL作為儲(chǔ)備液，從中量取2.00mL用蒸餾水定容至50mL搖勻、備用.

1.6 Folin-Ciocalteu試劑法比色條件的研究

1.6.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

吸取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，顯色，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～900nm范圍內(nèi)掃描，選定最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)[5-6].

1.6.2 顯色溫度的選擇

精密吸取1.00mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，搖勻.分別置于15，20，25，30，35℃的水浴鍋中加熱顯色150min，在764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.

1.6.3 顯色時(shí)間的選擇

精密吸取1.00mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，搖勻.將試管放置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色，反應(yīng)時(shí)間分別為60，90，120，150，180min，顯色后于764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.

1.6.4 Folin-Ciocalteu試劑用量的選擇

精密吸取1.00mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液分別置于20mL試管中，加入FC試劑1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，搖勻，靜置5min，分別加入同體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，于764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.

1.6.5 Folin-Ciocalteu試劑與10%Na2CO3比例的選擇

精密吸取1.00mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10mL試管中，加入FC試劑1.0mL，搖勻，靜置5min，加入不同體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液，使FC試劑與10%Na2CO3溶液體積比分別為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，置于25℃水浴鍋中加熱顯色150min，于764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25mL容量瓶中加入蒸餾水定容、搖勻.從上述不同濃度的溶液中，移取5.00mL到100mL容量瓶中，分別加入50mL蒸餾水，加入FC試劑2.0mL搖勻，靜置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液2.0mL，用蒸餾水定容，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白作參比，于最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度W（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[7].

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

掃描圖譜如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)品在400～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)只有一個(gè)單峰，且最大吸收波長(zhǎng)為764nm，因此確定764nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品紫外掃描圖

2.1.2 顯色溫度的選擇

由圖2可知，隨著溫度升高，吸光值逐漸增大，當(dāng)溫度到達(dá)25℃時(shí)，吸光值達(dá)到最大值，隨后隨著溫度的升高而降低，因此選擇25℃作為顯色溫度.

圖2 反應(yīng)溫度與吸光值的關(guān)系

2.1.3 顯色時(shí)間的選擇

由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光值逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到150min后增加不再明顯，曲線變得平坦，因此選擇150min作為顯色時(shí)間.

圖3 反應(yīng)時(shí)間與吸光值的關(guān)系

2.1.4 Folin-Ciocalteu試劑與10%Na2CO3比例的選擇

由圖4可知，隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液加入量的增加，吸光值逐漸增加，當(dāng)加入FC試劑與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液的體積比為1∶1時(shí)，吸光值達(dá)到最大，因此選擇兩者體積比1∶1作為顯色條件.

圖4 FC試劑與10%Na2CO3試劑比例與吸光值的關(guān)系

2.1.5 Folin-Ciocalteu試劑用量的選擇

由圖5可知，相同條件下比色液吸光值隨FC試劑用量的增加先增加，后降低，當(dāng)FC試劑的用量為2.0mL時(shí)吸光值達(dá)到最大，因此顯色時(shí)FC試劑的用量選擇2.0mL.

圖5 FC試劑用量與吸光值的關(guān)系

2.1.6 線性關(guān)系

由圖6可見(jiàn)，沒(méi)食子酸在濃度為1-6μg·mL-1時(shí)，沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度與其吸光值呈良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為A=0.0966W-0.0054，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987.

2.2 總多酚含量測(cè)定方法的考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)

圖6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取懷山藥零余子樣品溶液1.00mL置于10mL試管中，平行5份，各加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，分別為0.506，0.511，0.513，0.509，0.508，平均值為0.509，其RSD=0.54%（n=5），顯示該方法具有較高的精密度，能滿(mǎn)足樣品分析的要求.

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取懷山藥零余子樣品溶液1.00mL置于10mL試管中，加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液2.0mL，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，顯色完全后，分別放置0，10，20，30，40min測(cè)定吸光值，分別為0.514，0.513，0.510，0.508，0.504，平均值為0.510，RSD=0.79%（n=5），表明實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性良好.

2.2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.10mL已知懷山藥零余子多酚質(zhì)量濃度為1.00mg·mL-1的樣品溶液5份，分別精密加入含有40.00，80.00，120.00，160.00，200.00μg沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，各加入FC試劑2.0mL，搖勻，靜置5min，加入.02mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，測(cè)定結(jié)果并計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品多酚含量的測(cè)定

分別精密吸取懷山藥及其零余子樣品溶液1.00mL加入試管中，各加入FC試劑2.00mL，搖勻，靜置5min，加入2.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液，置于25℃的恒溫水浴鍋中加熱顯色150min，以試劑空白為參比，于764nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值，平行測(cè)定3次，得懷山藥零余子樣品吸光值分別為0.509，0.510，0.509，平均值為0.509，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出懷山藥零余子總多酚含量為0.0666%；懷山藥樣品吸光值分別為0.340，0.336，0.339，平均值為0.338，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出懷山藥總多酚含量為0.0447%.

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，研究了福林酚試劑法測(cè)定多酚的條件，經(jīng)試驗(yàn)得出測(cè)定波長(zhǎng)為764nm，確定了福林酚試劑的最佳用量為2.0mL、福林酚試劑與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%Na2CO3的最佳比例為1︰1、最佳溫度為25℃、反應(yīng)時(shí)間為150min.該測(cè)定方法的平均回收率為98.69%，RSD為1.56%，具有較好的精密度.該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于懷山藥及其零余子實(shí)際樣品的測(cè)定.

實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)懷山藥及其零余子的多酚含量的測(cè)定，結(jié)果表明：懷山藥總多酚含量為0.0666%，懷山藥零余子中總多酚含量為0.0447%，懷山藥零余子中總多酚的含量高于懷山藥.

本研究未對(duì)懷山藥零余子總多酚及鞣質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，還需進(jìn)一步加強(qiáng)研究.

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