朱春紅，陶志云，宋 遲，宋衛(wèi)濤，胡 艷，束婧婷，章雙杰，李慧芳

（江蘇省家禽科學(xué)研究所生物技術(shù)研究室，江蘇揚(yáng)州225125）

胚胎以及成體骨骼肌發(fā)育過程中均依賴于生肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）家族的精準(zhǔn)調(diào)控，MRFs家族成員包括肌分化因子MyoD1、肌細(xì)胞生成素MyoG （Myogenin）、生肌決定因子Myf5和Myf6［1－3］，調(diào)控從前體肌細(xì)胞的定型、增殖以及肌纖維的形成，直到個(gè)體出生后肌肉的成熟和功能的完善等肌肉發(fā)生發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)，且其功能與之在骨骼肌發(fā)育過程中的表達(dá)時(shí)序性關(guān)系密切［4］。MRFs家族在骨骼肌細(xì)胞的決定和分化中都是必需的，但其在肌肉發(fā)育過程中的作用不同，在肌肉發(fā)育初級(jí)階段，MyoD1和Myf5主要在成肌前體細(xì)胞的命運(yùn)決定和成肌細(xì)胞增殖中起作用［3］，而肌肉發(fā)育次級(jí)階段中MyoG和Myf6 基因則在成肌細(xì)胞的融合和分化中起作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)家禽生肌調(diào)節(jié)因子MRFs家族的研究主要集中于其基因多態(tài)性與生產(chǎn)性狀或者繁殖性狀的相關(guān)性上［5－7］，而對(duì)其表達(dá)模式的研究相對(duì)較少。

本研究以高郵鴨和金定鴨為研究對(duì)象，采用qPCR 技術(shù)研究不同品種鴨胚胎期以及初生期胸肌中MyoD1基因的發(fā)育性表達(dá)變化，并分析MyoD1基因的表達(dá)變化與骨骼肌發(fā)育變化的相關(guān)性，以探索其在胸肌發(fā)育過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在相同日糧水平以及相似飼養(yǎng)條件下，收集高郵鴨和金定鴨種蛋，孵化前進(jìn)行稱重、消毒和編號(hào)，品種內(nèi)蛋重變異系數(shù)在2%以內(nèi)。2組種蛋隨機(jī)置入同一孵化箱，在相同條件下（溫度為37.5～37.8℃，相對(duì)濕度為50%～70%）同時(shí)孵化。種蛋入孵后24h設(shè)定為1胚齡，分別于6個(gè)時(shí)間點(diǎn)（13、17、21、25、27胚齡和出雛后7日齡）采集胸肌樣品，稱重后，置于液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入－80 ℃冰箱保存。各品種各時(shí)間點(diǎn)采集16個(gè)個(gè)體，公母各半。

1.2 主要試劑和儀器

TRNzol－A＋總RNA 提取試劑（DP421）、SuperReal PreMix（SYBR Green）（FP204－01）、Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒（QuantScript RT Kit，KR103－04）、pGM－T 克隆試劑盒（VT302－02）、質(zhì)粒小提試劑盒（TIANprep Mini Plasmid Kit，DP103－02）、DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒（TIANquick Midi Purification Kit，DP204－02）購(gòu)自TIANGEN 公司；DNA Marker DL2000 為 TakaRa 公司產(chǎn)品。9700PCR 儀和Mx3000P熒光定量PCR 儀（愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)上海有限公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500）；紫外分光光度計(jì)（GeneQuant II，Pharmacia Biotech）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA 提取和cDNA 合成 肌肉總RNA提取按TRNzol－A＋總RNA 提取試劑的說明書進(jìn)行。RNA 樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，保證RNA 樣品質(zhì)量可靠，計(jì)算樣品總RNA 濃度。cDNA 第1鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書進(jìn)行，用持家基因GAPDH 檢測(cè)cDNA 合成質(zhì)量以及是否有基因組DNA 殘留。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)、目的片段的克隆 根據(jù)Gen－Bank 中鴨MyoD1 mRNA 序列（登錄號(hào)為：FJ374143.1）采用Primer Premier 5.0軟件在外顯子區(qū)設(shè)計(jì)PCR 引物，并交由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為MyoD1－F：5＇－AAGGCGTGCAAGAGGAAGAC－3＇，MyoD1－R：5＇－TGGTTGGGGTTGGTGGA－3＇，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為131bp；PCR 反應(yīng)體系：PreMIX 10μL，上下游引物各0.5 μL （10 μmol／L），模板cDNA 2 μL，RNase－Free ddH2O 7μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min；95℃30 s，55 ℃30s，72 ℃1min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠鑒定后，用DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒純化回收目的片段，與pGM－T載體相連接，然后轉(zhuǎn)化Eschericbia.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200r／min振搖培養(yǎng)過夜，用PCR 鑒定。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR［8］所用qPCR 采用SYBR Green I法，20μL 反應(yīng)體系如下：RealMasterMix（SYBR GreenI）9μL （2.5×Real Master Mix，20× SYBRsolution），上下游引物各0.5μL（10μmol／L），cDNA 模板2μL，加ddH2O 8μL 補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件：按試劑盒說明，95 ℃2 min，94 ℃20s；60 ℃20s、72 ℃20s共40 個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5℃／30s的速率從60 ℃遞增到95 ℃。每次反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品（各重復(fù)3次）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

（1）標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)計(jì)算：樣本分子量＝堿基數(shù)×324；拷貝數(shù)（copies／uL）＝標(biāo)準(zhǔn)品濃度／樣本分子量×6×1014。

（2）根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將得到的未知樣本Ct值代入線性方程即可得出未知樣本拷貝數(shù)。

運(yùn)用SPSS 20.0軟件中One－way ANOVA 和Bivariate Correlation分析胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量與胸肌重的相關(guān)性。P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鴨品種發(fā)育早期胸肌組織中MyoD1mRNA 表達(dá)

鴨胚胎期和初生早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)結(jié)果見圖1。由圖1可見，MyoD1mRNA 在高郵鴨和金定鴨的胸肌組織不同發(fā)育時(shí)段均有所表達(dá)，且在上述兩個(gè)品種胸肌組織中表達(dá)模式相似，均呈“波浪形”，在13胚齡時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高，17胚齡時(shí)下降，21胚齡時(shí)表達(dá)量上升，隨后下降，出雛后又維持較高水平，高郵鴨27胚齡及金定鴨25胚齡時(shí)胸肌組織中的表達(dá)量極顯著水平低于金定鴨13胚齡的表達(dá)量（P＜0.01）。

不同鴨品種間表達(dá)量分析比較發(fā)現(xiàn)，除了在25胚齡時(shí)金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量稍低于高郵鴨，在其他所檢測(cè)的胚齡／日齡中，金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 表達(dá)量均高于高郵鴨胸肌中的表達(dá)量，但表達(dá)量在品種間的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 鴨發(fā)育早期胸肌MyoD1 mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重量變化的二元變量相關(guān)性

高郵鴨和金定鴨發(fā)育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重量發(fā)育的二元變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，高郵鴨胸肌中MyoD1 mRNA 的表達(dá)與胚重以及胸肌重的發(fā)育變化不相關(guān)；而金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重的發(fā)育變化表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)（P＝0.048），與胸肌重發(fā)育變化呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)（P＝0.006），金定母鴨的相關(guān)水平要高于公鴨。具體結(jié)果如表1所示。

圖1 高郵鴨和金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 發(fā)育性表達(dá)變化Fig.1 Expression change of MyoD1mRNA in pectorales of Gaoyou duck and Jinding duck

表1 鴨發(fā)育早期胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重發(fā)育變化的二元變量相關(guān)性分析Table 1 Bivariate correlation analysis of MyoD1mRNA expression and weight development changes of embryo and pectorales

3 討論

國(guó)內(nèi)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的兩個(gè)地方鴨品種－高郵鴨和金定鴨在骨骼肌發(fā)育等相關(guān)性狀上存在明顯表型差異，是研究肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的理想動(dòng)物模型［8］，因此本研究選用上述兩個(gè)品種進(jìn)行鴨發(fā)育早期胸肌組織中MyoD1 基因的表達(dá)差異分析。MyoD1 mRNA 在不同品種鴨胸肌的表達(dá)變化表現(xiàn)出一致的規(guī)律性，呈“波浪型”，在13胚齡時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高，17胚齡時(shí)下降，21胚齡時(shí)上升到最高，隨后下降，出雛后又維持較高水平。在鴨出殼后的表達(dá)量仍維持一定的表達(dá)水平，推測(cè)MyoD1 基因在胚胎形成后肌肉的發(fā)育過程中也起重要作用，一方面胚胎形成后仍有部分成肌細(xì)胞處于增殖和早期決定階段，需要通過MyoD1基因以及Myf5基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這些細(xì)胞的早期命運(yùn)決定；另一方面，這可能與MRFs家族各成員間的復(fù)雜作用關(guān)系有關(guān)［9］。

金定鴨胸肌中不同胚齡間的表達(dá)差異水平較高郵鴨大，金定鴨除25 胚齡外，其他胚齡／日齡中MyoD1mRNA 的表達(dá)量均高于高郵鴨。Cinar報(bào)道在6月齡皮特蘭豬和杜洛克豬腰肌中MyoD1 mRNA 表達(dá)量無(wú)顯著的品種差異［10］，這可能和其只檢測(cè)發(fā)育過程中的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)有關(guān)。另外，MyoD1基因表達(dá)量和胚重、胸肌發(fā)育變化的二元變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)金定鴨胸肌中MyoD1mRNA 的表達(dá)與胚重、胸肌重發(fā)育負(fù)線性相關(guān)水平分別達(dá)顯著和極顯著水平，而在高郵鴨中未檢測(cè)出顯著水平的相關(guān)，這可能與MyoD1 基因在不同品種胸肌組織中的不同水平有關(guān)。Cinar等［10］利用主成分分析方法分析MyoD1基因?qū)?月齡皮特蘭豬和杜洛克豬肌肉發(fā)育影響，結(jié)果表明MyoD1 基因的表達(dá)對(duì)上述兩個(gè)豬品種腰肌肌肉生長(zhǎng)的權(quán)重值相當(dāng)，本試驗(yàn)結(jié)果和Cinar的研究結(jié)果存在差異，這一差異可能是由于物種（家禽／哺乳動(dòng)物）差異所致。

MyoD1基因在鴨胚以及鴨初生期的發(fā)育性表達(dá)分析研究結(jié)果顯示，上述基因不但在胚胎期鴨早期發(fā)育中發(fā)揮重要作用，且在鴨新生早期的發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)對(duì)MyoD1基因表達(dá)規(guī)律及表達(dá)模式的研究，為研究鴨鴨骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為提高地方品種鴨產(chǎn)肉性能和提高肉品質(zhì)提供新的育種信息。

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