周劍 王錫山

我國結(jié)直腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤中第3位，且以每年4．2%的速度上升，5年生存率約為27%［1］。結(jié)直腸癌患者中早期診斷的患者僅約11%左右［2］，大多數(shù)患者在就診時已經(jīng)出現(xiàn)遠期轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個涉及多步驟多因素的復雜過程，具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞脫離原發(fā)病灶，以極少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到血液、骨髓、淋巴結(jié)或遠處器官中，運用常規(guī)的檢測手段難以發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象稱為腫瘤的微轉(zhuǎn)移(Micrometastasis)。腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了可能。因此，在外周血中檢測循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTC)逐漸成為臨床研究的熱點。本文就CTC在結(jié)直腸癌的檢測、應用及新的研究方向等方面進行綜述。

一、CTC概述

1869年，澳大利亞病理學家Ashworth在一例腫瘤患者的外周血中觀測到腫瘤細胞，認為其為引起腫瘤轉(zhuǎn)移的原因之一，并首次提出了循環(huán)腫瘤細胞的概念。CTC的定義是:外周血中由腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放入血、具有腫瘤特異性抗原或基因特征的腫瘤細胞?，F(xiàn)今人們已在包括結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管癌等類型的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CTC［3］。CTC的發(fā)現(xiàn)，對腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究及腫瘤診療有重大的意義。通過研究CTC可以發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的微妙變化，并能為患者的預后判斷、病情評估及治療反應等方面提供參考。

二、CTC的形成與腫瘤轉(zhuǎn)移

CTC是指由實體腫瘤組織脫落并釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。獲得高侵襲性表型的原發(fā)灶腫瘤細胞，侵犯周圍基質(zhì)并進入血液循環(huán)，成為CTC。離開血液循環(huán)，進入繼發(fā)臟器的局部微環(huán)境，逃脫機體的免疫監(jiān)視，到達遠處臟器，存活并發(fā)生克隆增殖。如其能獲得充足的血供，最終將形成肉眼可見的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。CTC也可向骨髓歸巢，進入骨髓儲備池并維持靜息狀態(tài)，在一定條件下可再次釋放入外周血循環(huán)，活化增殖形成遠處轉(zhuǎn)移灶［4］。CTC與腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)間的關系已被眾多研究所證實［5］。CTC具有CSC的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，此外上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)也是其生物學特征之一。腫瘤組織可招募一系列的基質(zhì)細胞，通過分泌大量細胞因子和趨化因子等，使鄰近細胞分化為誘導型腫瘤干細胞，獲得轉(zhuǎn)移潛能。部分具有高侵襲能力的CTC即來源于這些發(fā)生EMT的細胞。在此過程中，一系列的EMT靶基因受到調(diào)控，上皮細胞的標志物如鈣黏蛋白、細胞角蛋白(cytokeratin，CK)等表達下調(diào)。同時，間充質(zhì)細胞的標志物如彈性蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達顯著上調(diào)。這些標志物表達含量的改變，意味著僅用上皮細胞的表面標志物來定義CTC將會遺漏發(fā)生EMT的細胞，而該群細胞往往是CTC中最具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能的亞群。

三、結(jié)直腸癌CTC檢測的方法

1．免疫細胞化學(immunocytochemistry，ICC)法:ICC 是基于抗原抗體結(jié)合反應的原理，將特異性的腫瘤標志物與單克隆抗體相結(jié)合，通過酶與底物反應顯色或其他顯色方法對腫瘤進行定位、定性和定量測定的技術。ICC的優(yōu)點是簡便、直觀并可進行細胞大小與形態(tài)學分析，把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。缺點是:(1)敏感性低，只能從105個正常細胞中發(fā)現(xiàn)一個腫瘤細胞，而且腫瘤細胞表面抗原表達的不均一性，也在一定程度上降低了檢測的敏感性［6］。(2)許多分化差的腫瘤細胞不能表達目標抗原、部分淋巴細胞交叉反應等因素都會影響CTC檢測的特異性。(3)檢測的腫瘤細胞抗原較高的表達豐度，而且鏡下對結(jié)果的觀察和判讀主觀性較強，限制了ICC在結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應用。所以目前較少單獨應用傳統(tǒng)的ICC方法檢測結(jié)直腸癌外周血循環(huán)腫瘤細胞。有學者提出用磁性細胞分選技術或密度梯度離心法對腫瘤細胞進行富集后再用ICC檢測，目的是為了提高ICC檢測的敏感性和特異性。由此看出，磁性細胞分選技術與ICC相結(jié)合可以彌補技術上的不足，提高了CTC檢測的敏感性和特異性。

2流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM):FCM是一項集計算機技術、激光、電子物理、流體動力學、細胞熒光化學、單克隆抗體等方法為一體的新型技術，該技術主要是運用標記熒光物質(zhì)的單克隆抗體與腫瘤細胞特異性的標志物結(jié)合，使腫瘤細胞染色，然后用流式細胞儀進行測量分析［7］。FCM的優(yōu)點主要是可在免疫放大檢測CTC的同時對癌細胞的形態(tài)進行定量測定，可以提供DNA倍數(shù)性的關系，而且測量速度較快，檢測數(shù)據(jù)較精確。同時，F(xiàn)CM還可進行多參數(shù)測量，并可對細胞進行分析與分選。流式細胞術檢測結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞需要將針對腫瘤細胞標志物的單克隆抗體結(jié)合熒光物質(zhì)(如異硫氰酸熒光素)等使腫瘤細胞染色，然后用流式細胞儀進行分析，著色細胞即被視為陽性。Cohen等［8］人在研究結(jié)直腸癌患者時，利用FCM技術在每7．5ml血液中檢測出2個CTC，而且結(jié)果顯示CTC的檢出率與病理分期有顯著的相關性，這對結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移的診斷具有一定的臨床意義。同時，Cohen發(fā)現(xiàn)，CTC在治療前后數(shù)目的變化與影像學聯(lián)合應用也可以作為判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的重要因素。FCM在CTC檢測方面的局限性:(1)缺乏規(guī)范的操作方法，價格昂貴且時間較長，不同文獻報道的流式細胞術檢測循環(huán)腫瘤細胞的結(jié)果差異很大。(2)標本固定貯存及研究人員間的差異因素的干擾。(3)FCM的敏感性較低。檢測腫瘤細胞的價值在很大程度上依賴于可分析的細胞數(shù)量［9］。FCM檢測靶細胞的敏感度僅為1×104，而外周血中腫瘤細胞數(shù)量常少于1×106，因此受篩檢細胞數(shù)的限制，單純依靠FCM檢測微轉(zhuǎn)移的方法有一定的局限性，而主要用于骨髓微轉(zhuǎn)移的檢測和有明顯轉(zhuǎn)移的進展期患者外周血的腫瘤細胞的檢測［10］。有文獻指出，將FCM與其他細胞富集技術聯(lián)用可對CTC進行特異性富集，提高方法的敏感性和鑒別力，可使CTC的檢出率更高［11］。

3．免疫磁珠分離檢測法:免疫磁珠分離技術(immunomagnetic separation，IMS)是近年來國內(nèi)外研究的一種新的免疫學技術，它能夠從大量外周血中篩選出帶有特異性標記的腫瘤細胞。免疫磁珠是均勻的、球狀的、具有超順磁性及保護殼的微粒。其基本原理主要是細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠免疫復合物，該復合物在外加磁場的作用下發(fā)生力學移動，將含有靶抗原的目的細胞與其他細胞分離，從而達到特異性分離細胞的目的［12］。該方法的優(yōu)點在于分選過程中避免了細胞溶解，降低了后續(xù)鑒定工作中的干擾因素，并可對細胞進行計數(shù)、染色、核酸分析以及藥物敏感實驗。免疫磁珠分離技術包括陽性分選和陰性分選兩種方法。陽性分選即與磁珠結(jié)合的細胞就是所要分離獲得的靶細胞;陰性分選則利用免疫磁珠去除無關細胞，游離于上清液的細胞為所需細胞。在試驗中，技術人員多將陽性分選與陰性分選相結(jié)合以進一步降低血細胞的含量，提高富集效率。有報道稱該技術的富集效率與一般的分離方法相比可提高1×103～1×104倍［13］。有研究人員將免疫磁珠與免疫細胞化學、RT-PCR、流式細胞術等方法相聯(lián)合起來檢測CTC，大大彌補了這些檢測技術所存在的缺陷，提高了這些檢測技術的敏感性和特異性。實驗證明IMS與上述方法聯(lián)合后提高了靈敏度和特異性，而且方便快捷，同時提高了癌細胞的檢測率，將可能有助于早期腫瘤患者微轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)、術后患者腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移的檢測、預后評估、治療策略的選擇以及臨床分期的重新確定［14］。但該技術在富集CTC的有效率以及檢測微轉(zhuǎn)移的研究中仍存在一些問題，例如受試者的炎癥性疾病、組織創(chuàng)傷、樣本中非腫瘤標志物的表達以及手術干預、采血時的操作都會得出假陽性的結(jié)果;而分離過程中CTC的丟失、循環(huán)中的腫瘤細胞的高度異質(zhì)性等因素則會造成假陰性的結(jié)果。

4．cellsearch系統(tǒng):cellsearch系統(tǒng)是惟一被美國美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準用于臨床檢測CTC的技術，是目前自動化程度最高的CTC檢測技術。受人為因素影響較小，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，具有較高的特異性、敏感性及可重復性，是基于免疫學原理的檢測方法。首先，cellsearch系統(tǒng)利用EPCAM抗體磁珠富集CTC，然后在外加磁場的作用下對血液中提取、分離出來的CTC進行通透、固定，再用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8、CK18以及CK19熒光抗體標記細胞，最后采用半自動四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測分析［15］。系統(tǒng)的這種半自動特征使得樣本的檢測非常迅速，而且具有很好的重復性。cellsearch系統(tǒng)所需的血液樣本在含有一種特殊防腐劑的試管中存放72h后，仍能檢測到精確的CTC數(shù)目，表明該方法的敏感性很高，而且只需7．5ml血液樣本，即可從400多億血細胞中檢測到一個CTC［16］。劉志東等［17］研究發(fā)現(xiàn)外周血CTC的存在可被視為腫瘤TNM分期的MX狀態(tài)，作為精確臨床分期的必要補充，有利于對患者的預后作出更準確的預測。Sastre等［18］使用cellsearch系統(tǒng)檢測大腸癌患者CTC，結(jié)果顯示CTC陽性(CTC≥2個)率與原發(fā)腫瘤部位、癌胚抗原、乳酸脫氫酶升高水平及腫瘤分化程度無關，但與結(jié)腸癌的臨床分期有關，且CTC在結(jié)腸癌的早期階段即可檢測到，表明CTC檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。然而，cellsearch系統(tǒng)操作步驟繁瑣，技術要求高，價格昂貴，并且只能檢測出EPCAM抗體陽性的CTC。因此，目前仍沒有大規(guī)模的應用于臨床。

5．聚合酶鏈反應:(polymerase chain reaction，PCR)主要是通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體重排產(chǎn)生的異常DNA。此方法雖然敏感性高，但易出現(xiàn)假陽性，且適用范圍比較有限。此外，由于外周血中的CTC和核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測到的游離DNA可能僅僅是核酸而非真正的腫瘤細胞。因此應用PCR技術通過DNA標記指標檢測CTC的特異性不高，在臨床實踐中尚不能達到理想的效果［19］。

6．逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR):此技術以腫瘤和上皮組織中某種物質(zhì)的mRNA為標志物檢測結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞。RT-PCR及其各種改進的技術目前在循環(huán)腫瘤細胞的檢測中應用最廣泛，且被認為是目前檢測循環(huán)腫瘤細胞最有效的方法。RT-PCR檢測CTC是在PCR的基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片段，從而識別組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后RNA水平的異常。由于這些特異性mRNA通常不表達于正常外周血細胞，且半衰期較短，在細胞死亡后會迅速被RNA酶降解，因此在外周血中檢測到的這些特異性mRNA可以間接提示CTC的存在［20］。

7．光纖陣列掃描技術法:此方法將外周血的細胞固定于玻片，無需進行CTC富集純化，采用自動化數(shù)字顯微鏡以30萬個細胞/s的速度進行高速掃描，在玻片上直接定位經(jīng)熒光探針標記的腫瘤細胞。該法具有高通量、高靈敏度的優(yōu)點。由于其探針也采用上皮細胞標記，故同樣無法鑒定出EMT 的腫瘤細胞［21］。

四、CTC與結(jié)直腸癌手術的關系

手術操作的影響會影響患者術后早期CTC數(shù)目，此時的CTC數(shù)目不具有預后意義［22］。如果術后1周CTC仍存在，則成為術后復發(fā)的危險信號［23］。CTC既可來源于腫瘤原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶，又可來自微轉(zhuǎn)移灶［24］。有報道稱進行經(jīng)直腸超聲檢查可使結(jié)直腸癌患者的CTC水平較檢查前升高，且這一部分患者預后較差［25］，提示超聲探頭對腫瘤的擠壓，可能會促進腫瘤細胞向外周血擴散。由此聯(lián)想到腸鏡、結(jié)腸三維重建CT、盆腔核磁等應用結(jié)直腸癌定位、定性診斷中同樣存在腫瘤細胞脫落的可能性。由此可見在對結(jié)直腸癌患者進行各種診療操作時，應注意避免腫瘤細胞的醫(yī)源性血液播散［26］。

五、CTC在結(jié)直腸癌化療中的作用

CTC可作為患者化療敏感性的指標之一，CTC的持續(xù)存在常常提示腫瘤對化療不敏感，CTC在患者化療過程中的變化，是決定患者化療敏感性及預后的因素之一，可作為結(jié)直腸癌患者個體化治療的一個參考［27}。

六、CTC與結(jié)直腸癌患者預后的關系

隨著結(jié)直腸癌患者的疾病進展，CTC陽性率逐漸增加［28}。外周血中CTC的數(shù)目與患者的5年生存率成反比關系，并且是結(jié)直腸癌患者遠處轉(zhuǎn)移以及預后的獨立危險因素，可用于判斷出現(xiàn)術后復發(fā)的風險［29］。與常規(guī)的腫瘤標記物(CEA/CA199)相比，CTC對結(jié)直腸癌患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的警示要比CEA早大約12個月。

七、直腸癌CTC檢測的臨床意義

現(xiàn)今結(jié)直腸癌的臨床分期主要是依據(jù)TNM和Dukes分期標準，并不包括外周循環(huán)中的腫瘤細胞。一般認為，結(jié)直腸癌在轉(zhuǎn)移的形成過程中，腫瘤細胞在到達遠處器官之前必先在血液中循環(huán)。雖然并非所有循環(huán)中的癌細胞均能存活，但循環(huán)性癌細胞與腫瘤患者的復發(fā)和不良預后密切相關。因此，檢測結(jié)直腸癌患者的循環(huán)腫瘤細胞的狀態(tài)，可以作為現(xiàn)有的腫瘤臨床分期方法的補充，從而精確腫瘤分期，更準確判斷預后。檢測結(jié)直腸癌患者循環(huán)腫瘤細胞的狀態(tài)可以區(qū)別部分早期患者，采取針對性的治療措施［30］。

綜上所述，大量研究證實CTC與結(jié)直腸癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關，檢測CTC有助于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測及預后判斷，并為結(jié)直腸癌患者個體化治療提供臨床指導。當然還存在很多爭議。(1)目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性非常高的腫瘤標志物。(2)CTC在循環(huán)中釋放是隨機的還是具有周期性和規(guī)律性。(3)缺乏有效的收集方法，因此會對收集的有效性和科學性造成影響，進而可直接到影響結(jié)果的可信度。(4)眾多的檢測方法均缺乏公認的檢測標志、鑒定方法，尚無統(tǒng)一的規(guī)范。筆者認為同一檢測方法，需保證患者準備、標本采集、樣本處理的標準化，保證檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠。不同檢測方法間，應開展比對，并及時進行結(jié)果分析。CTC檢測技術的不斷發(fā)展和改進，將有助于我們更深入的了解結(jié)直腸癌的生物學性征，動態(tài)分析腫瘤分子的特性，更加及時、更加有效和更加完善的改善患者的預后，提高患者的生存率，為真正個體化治療提供依據(jù)。

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