鄧展?jié)?章文文 綜述 易龍 審校

（南京大學(xué)，江蘇南京 210046）

法洛四聯(lián)癥與FOG2基因研究進展

鄧展?jié)?章文文 綜述 易龍 審校

（南京大學(xué)，江蘇南京 210046）

法洛四聯(lián)癥（TOF）是最常見的發(fā)紺型先天性心臟病，發(fā)病率為1／3000，占所有先心病的10%，嚴重危害患兒健康。FOG2基因編碼一種富含鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白，與轉(zhuǎn)錄因子GATA4相互作用調(diào)控心臟錐干的發(fā)育。FOG2基因敲除的小鼠擁有類TOF樣的心臟畸形，被認為是TOF的一種易感基因。TOF的形成和錐干發(fā)育異常有關(guān)，研究證實FOG2基因突變可以導(dǎo)致TOF。對ZFPM 2／FOG2基因的研究可以幫助我們了解法洛四聯(lián)癥的病因，也可能促進法洛四聯(lián)癥的基因診斷和基因治療。

法洛四聯(lián)癥；FOG2基因；GATA4

法洛四聯(lián)癥（tetralogy of fallot，TOF）是最常見的復(fù)雜先心病，新生兒發(fā)病率為1／3000，占先心病的10%［1］。TOF包括4種最基本的病理改變：主動脈騎跨、室間隔缺損、肺動脈狹窄和右心室肥大。TOF的臨床表現(xiàn)嚴重，甚至導(dǎo)致死亡，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過安置人工補片外科治療大大提高了TOF患兒的生存率。然而，0.5%～6%的患兒術(shù)后由于室性心動過速而猝死。事實上，即使缺口得到修復(fù)，用于修復(fù)的補片可能會引起心臟變形，影響右心室的正常收縮功能［2］。

組織學(xué)上，TOF是胚胎心臟發(fā)育神經(jīng)嵴細胞相關(guān)的錐干發(fā)育缺陷，第二心區(qū)心前細胞增殖、遷移和分化異常所致［3］。該區(qū)域含有表達GATA4蛋白的心前細胞，細胞遷移到原始心管的動脈極，影響錐干的發(fā)育和心肌壁的形成［4］。

迄今為止，TOF的病因仍然不清楚，一般分為遺傳類和非遺傳類的。非遺傳類的原因有環(huán)境致畸因子、孕前感染以及感染性疾病［5］。盡管數(shù)十年來，國際上專注于預(yù)防這些因素，但是這些非遺傳類因素種類越來越多而且更加多樣化。先心病的基因研究狀況同樣也發(fā)生了變化。最初的遺傳研究方法只有很低的分辨率，分析先心病的遺傳形式受到了限制?？紤]到先心病高死亡率和低生育率的比例，故早期的先心病的家系分析，都是偏向于簡單的畸形，比如室間隔缺損（V SD）和房間隔缺損（A SD）。但隨著先心病患者健康狀況的改善和基因組研究技術(shù)的發(fā)展，消除了對研究對象的局限。當代的技術(shù)為先心病患者進行廣泛的基因分析提供了豐富的機會，研究發(fā)現(xiàn)一些基因的突變與TOF的形成有關(guān)。

1 ZFPM 2／FOG2基因的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)以及編碼蛋白

GATA轉(zhuǎn)錄因子是在哺乳動物中造血（GATA-1／2／3）和心臟發(fā)生（GATA4）中重要的調(diào)節(jié)因子。GATA蛋白通過與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用共同調(diào)控GATA蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。Friend of GAT A4（FOG）是一種能與GATA1相互作用并能調(diào)控GATA1的轉(zhuǎn)錄活性的鋅指蛋白，1999年，Svensson等［7］在小鼠中克隆出另外一種FOG相關(guān)蛋白基因（FOG2基因）。他們發(fā)現(xiàn)FOG2基因編碼的FOG2蛋白位于8q22，含8個外顯子，包含1151個氨基酸，擁有8個鋅指結(jié)構(gòu)域，在結(jié)構(gòu)上與FOG蛋白高度同源。在小鼠的胚胎中，F(xiàn)OG2基因最先在心臟和膈肌中表達，隨后，該基因廣泛表達于小鼠的心臟、大腦和睪丸組織中。該研究組實驗結(jié)果提示小鼠FOG 2基因可以參與調(diào)節(jié)不同的中胚層細胞譜系的分化，并且在心臟發(fā)育過程中起到明顯的調(diào)節(jié)作用。

2 FOG2基因的表達和功能以及人類心臟的形成

1999年，Svensson等［7］研究發(fā)現(xiàn)小鼠FOG2蛋白能在體內(nèi)和體外與GATA4的N端鋅指特異性相結(jié)合。通過特異性結(jié)合，F(xiàn)OG2能調(diào)節(jié)GATA4的轉(zhuǎn)錄活性，因為在小鼠胚胎成纖維細胞和大鼠的心肌細胞中，F(xiàn)OG2基因的表達能抑制Gata4依賴性的轉(zhuǎn)錄過程。2000年，該研究組運用基因定位突變的方法來探究FOG2基因在正常心臟發(fā)生中的作用。研究顯示FOG2基因缺陷的小鼠在胚胎期的第13天因為充血性心力衰竭而死亡，表現(xiàn)為一種三尖瓣閉鎖綜合征，包括三尖瓣的缺失、嚴重的房間隔缺損、室間隔缺損、左心室流出道的延長、主動脈瓣向右移位和肺動脈狹窄。這些FOG2基因缺陷的小鼠在發(fā)育中同時也存在著左心室發(fā)育不全。該研究展示了FOG2在正常心臟的瓣膜發(fā)育中的重要作用以及提示了三尖瓣閉鎖綜合征的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

2000年，Tevosian等［8］通過敲除小鼠的FOG2基因來獲得FOG2-／-小鼠，敲基因小鼠在胚胎形成的中期死亡，表現(xiàn)出嚴重的心血管畸形，包括共同房室通道、心室肌發(fā)育不良、冠狀動脈缺失和法洛四聯(lián)征。另外，在FOG2-／-小鼠的心臟中，冠狀動脈發(fā)生非常明顯的缺失。而使FOG2在心肌細胞中重新表達能修復(fù)FOG2-／-小鼠的血管表型，進一步展示了FOG2基因在心肌中的作用以及在冠狀動脈的發(fā)育中至關(guān)重要。

2001年，Crispino等［9］建立了使GATA4蛋白單個氨基酸被取代的小鼠模型，削弱其與FOG2蛋白的相互作用。這些小鼠在胚胎期的第12天死亡，表型與FOG2-／-小鼠相似，除了GATA4突變小鼠還存在半月瓣的畸形和雙右室流出道。此項研究提示GATA4的功能依賴于FOG2蛋白和另一種心臟特異性FOG蛋白間的相互作用。

3 FO G2基因突變與TOF的關(guān)系

3.1 FOG2基因突變的研究 FOG2基因突變大多是外顯子的錯義突變、同義突變、移碼突變，以及5’UTR區(qū)的變異、非編碼的外顯子的變異、內(nèi)含子剪接異常、外顯子無義突變形成額外的終止密碼子和起始密碼子造成蛋白的截短或延長等。它的單個或多個基因的突變或異常表達均會導(dǎo)致心血管發(fā)育異常，影響心臟畸形的發(fā)生。

2003年，Pizzuti等［10］對47個TOF患者的FOG2基因進行測序，在其中2個患者中各發(fā)現(xiàn)了1個突變（S657 G、E30 G）。2011年，De Luca等［11］在1個散發(fā)的雙右室流出道的患者中，同樣發(fā)現(xiàn)了FOG2基因上E30 G這一突變。2005年，Ackerman等［12］在30個死亡的膈肌有缺陷的兒童中，在4號外顯子上發(fā)現(xiàn)了一個突變（R112 X），尸體解剖顯示患者具有肺發(fā)育不良和先天性膈疝。該研究提示FOG2基因這個突變可能會引起原發(fā)性的肺部和膈肌缺陷。2007年，Bleyl等［13］在96個先天性膈疝的患者中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因7號外顯子上的2個突變（M 703L、T843 A）。2012年，Tan等［6］在1個雙右室流出道患者中發(fā)現(xiàn)了同樣的突變（M 703L）。2011年，De Luca等［11］在1個散發(fā)的雙右室流出道的患者中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因6號外顯子的一個突變（I227 M），另外，在1個散發(fā)的TOF患者中，在FOG2基因8號外顯子上發(fā)現(xiàn)了另外一個突變（M544I）。2012年，Tan等［6］在1個雙右室流出道合并室間隔缺損的新生兒中發(fā)現(xiàn)了FOG2基因8號外顯子上的一個突變（K737E）

到目前為止，國內(nèi)外主要報道了13種導(dǎo)致先天性心臟病的FOG2基因突變，其中大多數(shù)都發(fā)生在多個不相干的家庭。而導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥的突變有3種：E30 G、S657 G、M 544I。其中S567 G和M 544I僅見于TOF患者，E30 G除了見于TOF患者外，還可以見于雙右室流出道的患者中。

2012年，我國趙明等［21］通過對106例TOF患者FOG2基因編碼區(qū)的突變或單核苷酸多態(tài)性位點的檢測，在16例不同患者FOG2基因的2、6、8號外顯子上，分別發(fā)現(xiàn)多個位點基因的改變，并將新發(fā)現(xiàn)的基因改變位點在110名健康人中進行驗證，證實其改變位點均為突變位點。V60E、E44 V突變點位于N端轉(zhuǎn)錄表達結(jié)構(gòu)域上，V339I突變點位于第3鋅指結(jié)構(gòu)域上，N868S突變位點位于第7鋅指結(jié)構(gòu)域上。另外，在外顯子8上還發(fā)現(xiàn)5個已知的SNPs：rs11993776、rs16873732、rs16873732、rs35998713、rs1442320。

近年來，國內(nèi)外對于FOG2基因與法洛四聯(lián)癥的研究開始發(fā)生停滯，原因是雖然確定FOG2基因突變與TOF的發(fā)病具有相關(guān)性，但是其中的機制卻缺乏一個能得到普遍認同的解釋，加上近年來的研究也沒有對FOG2基因?qū)OF的作用有新的提示與猜測。另一方面也增加FOG2基因與TOF關(guān)系與作用的可研究性。

3.2 FOG2基因突變導(dǎo)致法洛四聯(lián)癥的可能機制

隨著人們對FOG2基因結(jié)構(gòu)以及在心臟發(fā)育中的表達有了一定的了解，更多的研究方向轉(zhuǎn)向FOG2基因的功能和調(diào)控機制。

1999年，Pehlivan等［14］通過FISH分析發(fā)現(xiàn)一些基因型為del（8）（D23.1）的先天性心臟畸形患者，而8p23、l的中段缺失包括FOG2基因。這提示FOG2基因單倍體功能不全可能是一些先天性心臟畸形的病因?qū)W基礎(chǔ)。

2001年，Crispino等［9］運用基因定點突變技術(shù)改變GATA4的氨基端和FOG2結(jié)合的氨基酸，表現(xiàn)如基因敲除小鼠。研究發(fā)現(xiàn)在TOF患兒中存在FOG2基因突變，在正常對照人群中沒有發(fā)現(xiàn)。推測FOG2／GATA4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的變異在TOF患者心臟發(fā)育過程心前細胞的異常遷移和行為發(fā)揮作用。了解心臟前體細胞的行為，可以對以后不影響心臟血液動力學(xué)的外科修復(fù)提供臨床支持。

2003年，Pizzuti等［10］在47例TOF患者中發(fā)現(xiàn)2個FOG2基因編碼區(qū)的突變（S657、E30 G）。為了檢測突變是否改變FOG2蛋白的功能，運用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶GSTPull-dow n試驗結(jié)合T NT系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯突變蛋白（Pro mega，Madison，W I），SDS-PAGE檢測FOG2-GATA4復(fù)合物。研究證明，F(xiàn)OG2突變蛋白并沒有影響GATA4與FOG2蛋白的結(jié)合。隨后，為了研究突變的FOG2蛋白是否保留影響GATA4轉(zhuǎn)錄活性的能力，利用熒光報告基因試驗檢測GATA4的表達，發(fā)現(xiàn)E30 G突變的FOG2蛋白與野生型的FOG2蛋白對GATA4的抑制作用并無明顯差別，而S657 G突變的FOG2蛋白與野生型的FOG2蛋白相比，對GAT A4的抑制作用則有所降低。研究提示FOG2基因突變，雖然不影響FOG2蛋白與GATA4蛋白的結(jié)合，但卻可能通過降低FOG2蛋白對GATA4的抑制作用，影響GATA4的轉(zhuǎn)錄活性，而GATA4基因是一種在早期心臟發(fā)育過程中起作用的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，GATA4基因敲除小鼠不能形成腹側(cè)心管。通過這樣的機制，最終導(dǎo)致TOF和其他心血管畸形的形成。

類似的，2006年，Nemer等［15］在26例TOF患者中發(fā)現(xiàn)了1個GATA4第一個鋅指區(qū)域上的突變（E216D），這個突變同樣不影響GATA4與FOG2蛋白的結(jié)合，以及GATA4與DNA的結(jié)合，但卻降低了下游目標基因的轉(zhuǎn)錄活性。

無論是FOG2基因的突變還是GATA4基因氨基結(jié)合區(qū)域的突變，都不影響兩者的結(jié)合，但卻降低了FOG2基因?qū)ATA4的調(diào)節(jié)作用，可能通過這樣的機制，最終影響了心臟的發(fā)生，導(dǎo)致了TOF的形成。當然，現(xiàn)在對于FOG2和GATA4基因的研究還不夠深入，需要更多的研究與實驗進一步闡述FOG2基因的變異導(dǎo)致TOF發(fā)生的機制。

4 FOG2基因拷貝數(shù)量變化（CNV）與TOF的關(guān)系

4.1 拷貝數(shù)量變化（CNV）與人類疾病 拷貝數(shù)量變化（copy nu m ber variation，CNV）是由于基因組重排導(dǎo)致的主要結(jié)構(gòu)變異類型，包括亞顯微結(jié)構(gòu)下大于1kb基因片段的缺失和重復(fù)。CNV被認為是影響人類疾病的主要遺傳因素之一，突變頻率比單核苷酸多態(tài)性（SNP）高的多。CNV證實與孟德爾遺傳疾病、散發(fā)性疾病和復(fù)雜疾病的易感性有關(guān)，通過改變相關(guān)基因的劑量產(chǎn)生臨床表型［16］。各種機制參與CNV的形成，主要分為2大類：以DNA重組為基礎(chǔ)和DNA復(fù)制為基礎(chǔ)。

2010年，美國WTCC（The Wellco me Trust Case Control Consortium）協(xié)會運用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）對8種常見病的16 000例患者進行拷貝數(shù)量變化（CNV）的檢測。發(fā)現(xiàn)并證實克羅恩病、1型糖尿病的患者中存在拷貝數(shù)量變化（CNV）的改變［17］。類似的，先天性心臟病也極有可能與拷貝數(shù)量的變化存在極大的關(guān)系。

4.2 Alu序列介導(dǎo)的外顯子缺失和重復(fù)常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生 Alu序列是哺乳動物基因組中短分散重復(fù)序列家族（SIN E）的一員，約有50萬份拷貝。

也就是說平均4～6 kb中就有1個Alu序列。靈長類動物基因組中的許多Alu序列為不等同源重組事件提供了大量的機會，Alu序列也就成為了重組的熱點。這些重組事件如果發(fā)生在染色體內(nèi)，導(dǎo)致1個基因中外顯子的刪除或復(fù)制，當它們發(fā)生在染色體間時，會引起更復(fù)雜的染色體異常如易位或重排?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類許多疾病由Alu重復(fù)序列之間的不等同源重組引起的，如R B1基因缺失引起的神經(jīng)膠質(zhì)腦瘤、Dystrophin基因重復(fù)引起的Duchenne肌營養(yǎng)不良。Alu介導(dǎo)的突變大概占了人類遺傳病的0.3%［18］。

4.3 TOF患者中存在FOG2基因拷貝數(shù)量變化（CNV）的猜測 1991年，Gelb等［19］發(fā)現(xiàn)大約38%的8號染色體重組綜合征患者患有TOF，其中1個染色體斷裂點位于8q22，F(xiàn)OG2基因所在區(qū)域。2005年，Ackerman等［12］在1位先天性膈疝和肺發(fā)育不良的患者中發(fā)現(xiàn)一個無義突變（R112 X），突變位于鋅指結(jié)構(gòu)功能區(qū)前，由于生物體內(nèi)存在無義突變導(dǎo)致的m RNA降解，該突變相當于缺失一份等位基因。雖然從國內(nèi)外的報道中，TOF患者中FOG2基因的拷貝數(shù)量變化（CNV）都還沒有陽性發(fā)現(xiàn)，但從人類基因組數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)FOG2基因也富含Alu序列，據(jù)此，推測FOG2基因的CNV在TOF患者中是存在的，但是占的比例為多少，需要進一步研究。

4.4 TOF患者中拷貝數(shù)量變化（CNV）的檢測方法

目前，主要作為檢測點突變而開展的方法，如測序和變性高效液相色譜法，一般不能檢測拷貝數(shù)的變化。目前發(fā)展了很多檢測CNV的方法，Southern blot分析將揭示許多畸變，但不能發(fā)現(xiàn)小缺失，并且不是理想的常規(guī)技術(shù)；實時熒光定量PCR，可以檢測特點良好的缺失和擴增，但由于1個反應(yīng)只能針對1個位點，要準確地定位缺失位點還很麻煩；熒光原位雜交技術(shù)（FISH）使用特異性探針同細胞中期分裂相的染色體（或DNA纖維）雜交，能顯著提高結(jié)構(gòu)變異的清晰度，但由于工作量巨大，且不能檢測到較小缺失重復(fù)片段的單一基因畸變；比較基因組雜交技術(shù)（CGH）適用于整個基因組的研究篩選，但成本高，技術(shù)復(fù)雜；多重連接探針擴增技術(shù)（MLPA）是最早由荷蘭學(xué)者Dr.Schouten JP［20］于2002年提出，是一種高通量、針對待測核酸中靶序列進行定性和定量分析的新技術(shù)，它利用簡單的雜交（hybridization）、連接（ligation）及PCR擴增（PCR am plification）反應(yīng)，于單一反應(yīng)管內(nèi)可同時檢測40個不同的核苷酸序列的拷貝數(shù)變化。MLPA在檢測CNV變化尤其是基因內(nèi)的缺失和重復(fù)具有很大的優(yōu)勢，檢測從DNA提取、反應(yīng)至結(jié)果分析僅需2天。此外，因為所使用的反應(yīng)條件都相同，所以在相同的操作條件下MLPA技術(shù)有不同的應(yīng)用，可以平行處理不同的檢測項目。

5 檢測FOG2基因變異的臨床意義

2011年，Tan等［6］通過對FOG2基因與TOF發(fā)生的特異性和敏感度分析顯示，雖然其靈敏度不高，但有較高的特異性，據(jù)此可以為FOG2基因在TOF的產(chǎn)前診斷和基因治療提供依據(jù)。

FOG2基因是心臟發(fā)育過程中較早表達的轉(zhuǎn)錄因子，與GATA4相互作用貫穿心臟發(fā)育的全過程，在心臟的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。該基因發(fā)生變異將可能導(dǎo)致先天性膈疝、法洛四聯(lián)癥（TOF）或雙右室流出道（DORV），對于妊娠期的婦女，特別是帶有明顯家族史的婦女，通過抽取產(chǎn)前絨毛組織或羊水，進行FOG2基因篩查，結(jié)合胎兒超聲心動圖的檢查，提早發(fā)現(xiàn)心臟發(fā)育異常的胎兒，爭取早期治療和終止妊娠的機會，減輕家庭負擔和社會負擔。

6 結(jié) 語

迄今為止，國內(nèi)外研究對FOG2基因的結(jié)構(gòu)、功能和在心臟發(fā)育中的表達已經(jīng)有了一定的了解，也發(fā)現(xiàn)了多種FOG2基因的變異。但FOG2基因?qū)е峦蛔兊臋C制仍未得到普遍的認可。預(yù)測FOG2基因中存在拷貝數(shù)量變化（CNV）至今也還沒有陽性報道。而且國內(nèi)對FOG2基因的研究由于研究樣品小，所發(fā)現(xiàn)的突變是否為我國TOF的功能性致病位點，還需要進一步的研究與證實。

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編輯：宋文穎

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2013-07-12）