張小杰，蔣東霞，周 健，房佰俊，張龔莉，符粵文，魏旭東，宋永平

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科，河南鄭州 450003）

C57BL/6小鼠微小殘留白血病模型的建立

張小杰，蔣東霞，周 健，房佰俊，張龔莉，符粵文，魏旭東，宋永平

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院血液科，河南鄭州 450003）

目的探討構(gòu)建C57BL/6小鼠FBL-3微小殘留白血病(MRL）模型的方法。方法將5×106個FBL-3紅白血病細胞經(jīng)尾靜脈接種至C57BL/6小鼠，接種后第3天經(jīng)尾靜脈注射不同劑量環(huán)磷酰胺(CTX），觀察小鼠生存時間與藥物劑量間的關(guān)系;根據(jù)白血病小鼠生存時間與CTX劑量和與接種FBL-3細胞數(shù)量的關(guān)系，確定構(gòu)建小鼠MRL模型所需的化療藥物劑量。結(jié)果C57BL/6白血病小鼠對CTX敏感，隨CTX劑量增加白血病小鼠的生存時間逐漸延長，藥物劑量與生存時間有較好的回歸關(guān)系。移植生物試驗顯示，接種500個FBL-3細胞的小鼠生存時間與接受100 mg·kg－1CTX化療白血病小鼠相當。結(jié)論每只C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈接種5×106個FBL-3細胞3 d后給予100 mg·kg－1CTX化療可以建立MRL動物模型。

白血病細胞;微小殘留白血病;小鼠;模型

白血病患者化療緩解后體內(nèi)仍然殘留少量白血病細胞，這部分細胞即為微小殘留白血病(minimal residual leukemia，MRL）細胞。部分MRL細胞為白血病干細胞，對多種化療藥物耐受，是白血病化療和骨髓移植術(shù)后復(fù)發(fā)的根源。因此，檢測和根除MRL對徹底治愈白血病具有重要意義［1－2］。由于對人體內(nèi)MRL的分布和復(fù)發(fā)規(guī)律了解甚少，加上動物模型研究具有實驗周期短，容易得到規(guī)律性的結(jié)果，并且重復(fù)性好，敏感特異的檢測方法較多。因此，臨床檢測和治療MRL多以動物實驗為基礎(chǔ)，國內(nèi)外學(xué)者大多利用小鼠或大鼠動物模型開展研究［3－4］。為了構(gòu)建細胞株和動物傳代方便、重復(fù)性好的MRL模型，我們在原來建立的移植性C57BL/6小鼠FBL-3紅白血病模型的基礎(chǔ)上［5］，加用環(huán)磷酰胺(CTX）化療，建立FBL-3紅白血病MRL的C57BL/6小鼠模型，并初步研究了MRL細胞在體內(nèi)的分布規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和實驗動物 FBL-3白血病細胞株由河南省血液病研究所凍存。C57BL/6近交小鼠96只，雌雄各半，8～12周齡，體質(zhì)量18～22 g，平均(20±2）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)于清潔級實驗動物房中，按隨機數(shù)字表對實驗動物進行分組。

1.1.2 藥品、試劑和儀器 胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)有限公司），環(huán)磷酸胺注射液(山東齊魯制藥廠），RPMI-1640培養(yǎng)基(美國 Gibco公司），PBS平衡鹽溶液、細胞培養(yǎng)瓶、血細胞計數(shù)板、細胞凍存管、凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠），CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司），液氮罐、臺式離心機、生物顯微鏡(日本Olympus公司），倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理 常規(guī)方法復(fù)蘇FBL-3細胞，于RPMI-1640培養(yǎng)基(含胎牛血清體積分數(shù)15%，碳酸氫鈉1 ～ 2 g· L－1，HEPES 2.38 g· L－1，L-Glu 300 mg·L－1，青、鏈霉素各 200 u·L－1）中常規(guī)傳代培養(yǎng)，每3～4 d傳代1次。培養(yǎng)條件:體積分數(shù)5%CO2，飽和濕度:37℃。實驗用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 建立MRL模型 以我們原來的工作［5］為基礎(chǔ)，參考褚建新等［6］的方法進行。C57BL/6小鼠隨機分組，每組6只，雌雄各半，經(jīng)尾靜脈接種對數(shù)生長期FBL-3 細胞每只1 ×106個，接種3 d后以50、100、150、200、250、300 mg·kg－1CTX 化療后，記錄小鼠生存時間，繪制CTX劑量與小鼠生存時間關(guān)系表。

1.2.3 計數(shù)外周血白細胞(WBC） 小鼠眼眶采血，在庫特血細胞計數(shù)儀上計數(shù)WBC并分類，涂片Wright染色觀察外周血細胞。

1.2.4 觀察MRL的病理學(xué)結(jié)果 斷頸處死小鼠，取肝臟和脾臟，常規(guī)病理方法制作蠟塊、切片、HE染色，計數(shù)每10個低倍視野下的白血病細胞浸潤灶。

1.2.5 移植生物實驗 化療后第3天活殺小鼠，取小鼠股骨骨髓、脾臟和肝臟，制成單細胞懸液，每只健康C57BL/6小鼠腹腔接種5×106個FBL-3細胞，觀察記錄生存時間。

1.2.6 觀察生存時間 自接種之日起，每2.4 h為0.1 d，精確至死亡時止，夜間死亡而早晨發(fā)現(xiàn)者減去0.5 d。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，先行方差齊性檢驗和正態(tài)性檢驗，再行組間均數(shù)F檢驗和回歸相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量CTX化療后白血病小鼠外周血WBC變化 注射CTX的劑量與白血病小鼠外周血WBC數(shù)量有一定關(guān)系，化療后9 d內(nèi)，CTX量越大，WBC數(shù)量越低。化療后第5天WBC降至最低點，隨后又逐漸升高，在第16天升至化療前水平，接著升高速度增快，外周血出現(xiàn)白血病細胞，且比例逐漸增高。

2.2 病理學(xué)檢查結(jié)果 100 mg·kg－1的CTX化療后不同時間點對白血病小鼠的肝脾進行病理檢查，化療后第8天在肝內(nèi)檢測到白血病浸潤灶，第9天起病灶數(shù)量大幅度增加，第16天達(61.3±8.2）。以每10個低倍視野白髓個數(shù)來計數(shù)脾臟，化療后第6天起白髓面積明顯擴大，數(shù)量增多，但不能辨認出明顯的白血病細胞浸潤。

2.3 移植生物試驗 白血病小鼠化療后3 d，肝臟、脾臟和股骨骨髓均未檢出明顯的白血病細胞，將肝臟、脾臟和骨髓細胞接種正常C57BL/6小鼠，受鼠生存時間均大于60 d。由受鼠的生存時間推斷供鼠器官的殘留白血病細胞。

2.4 MRL模型的建立 接受不同劑量CTX化療后，CTX劑量每增加50 mg·kg－1，小鼠生存時間延長2～4 d?；熈吭黾拥?50 mg·kg－1以上時，盡管生存時間有所延長，但增長幅度明顯延緩，3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。CTX劑量和生存時間之間有良好劑量 －效應(yīng)關(guān)系，回歸方程為 y天數(shù)=0.15x劑量+7.38。結(jié)果顯示，隨著CTX劑量的增加，白血病小鼠體內(nèi)白血病細胞數(shù)逐漸下降，小鼠的生存時間逐漸增加?；焺┝窟_100 mg·kg－1時小鼠的存活時間相當于接種500個白血病細胞時小鼠存活時間，約為26 d，因此選擇100 mg·kg－1為MRL的造模劑量。不同劑量CTX化療后小鼠的存活時間見表1。

3 討論

小鼠造血系統(tǒng)特點與人類十分相似，同時近交系動物基因純合度高，遺傳背景均一，易于控制，重復(fù)性好。因此，選擇近交系小鼠構(gòu)建MRL模型更能近似反映人體的實際情況。國外的MRL實驗研究多采用BNML模型，該模型使用LT12細胞和BN大鼠建立，具有重復(fù)性好、發(fā)病規(guī)律等特點［7－8］。但國內(nèi)缺乏BN近交系大鼠，所以難以開展工作。我們前期應(yīng)用FBL-3細胞和C57BL/6小鼠建立了紅白血病模型，其結(jié)果顯示，C57BL/6小鼠接種1×103～1×107個FBL-3細胞，發(fā)病率均為100%，無自發(fā)緩解現(xiàn)象，并且接種FBL-3細胞數(shù)量與小鼠存活時間呈負相關(guān)。為了建立一種細胞株傳代方便、模型重復(fù)性好，能模擬人類急性白血病緩解和復(fù)發(fā)過程的MRL理想模型，作者在原工作基礎(chǔ)上，給予接種1×106個FBL-3細胞的C57BL/6小鼠不同劑量的CTX化療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CTX不僅可有效地殺滅白血病細胞，延長小鼠存活時間，而且其劑量與小鼠的存活時間有良好的劑量－生存時間關(guān)系。每增加50 mg·kg－1的CTX，小鼠存活時間增加2～4 d，小鼠全部死于白血病復(fù)發(fā)。因為接種500個細胞的小鼠存活天數(shù)與接種1×106個細胞后第3天給予CTX 100 mg·kg－1化療的小鼠生存時間相當。因此，我們選擇CTX 100 mg·kg－1為MRL的造模劑量。

表1 不同劑量CTX化療后小鼠的存活時間

移植生物試驗是檢測MRL模型全身各器官和部位MRL細胞的最敏感方法，Martens等［9］的研究資料顯示，其敏感性可達10－8～10－9。C57BL/6白血病小鼠化療后第3天，我們使用肝臟、脾臟和骨髓細胞進行移植生物試驗，結(jié)果顯示，小鼠肝臟、脾臟和骨髓中存在的白血病細胞均少于10個，與供鼠肝臟、脾臟病理檢查結(jié)果一致，受鼠存活時間均＞60 d。但按回歸方程 y劑量=121.45 －17.14 lg x細胞數(shù)推算，此時體內(nèi)應(yīng)殘留白血病細胞應(yīng)在10個左右。我們推測，這些白血病細胞可能存在于肝臟、脾臟和骨髓以外的組織器官中，MRL細胞在機體各組織器官的分布是不均勻的。這與Hagenbeek等［10］的實驗結(jié)果一致。

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Establishment of Minimal Residual Leukem ia Model in C57BL/6 Mice

Zhang Xiaojie，Jiang Dongxia，Zhou Jian，F(xiàn)ang Baijun，Zhang Gongli，F(xiàn)u Yuewen，Wei Xudong，Song Yongping
(The Tumor Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou，450003）

ObjectiveTo establish FBL-3 minimal residual leukemia(MRL）model in C57BL/6 mice.Methods5×106FBL-3 cellswere inoculated intravenously into C57BL/6mice and the relationship of the amountof inoculated cells and the survival time ofmouse was investigated.On the third day，cyclophosphamide(CTX）of different dose was infused into thesemice through vena caudalis and the relationship of the dose of CTX and the survival time ofmouse was investigated.Resultsof the above two stepswere combined to decide the dose of CTX in construction ofminimal residual leukemia model of FBL-3 cells in mice.ResultsThe survival time increased following the increase of the doses of CTX.Themodel of leukemia was sensitive to CTX and the time of survivalwas related to the dose of CTX

.The results of biological transplantation experiments indicated that the survival time of the inoculated mouse treated with CTX at100 mg·kg－1was equal to that of themouse inoculated with 500 FBL-3 cells without treatment.ConclusionMRL Model could be established by C57BL/6 mice intravenously inoculated 5 ×106FBL-3 cell and chemotherapy by 100 mg·kg－1CTX after inoculation the third day.

leukemia cell;minimal residual leukemia;mice;model

10.3969/j.issn.1673-5412.2013.02.002

R733.7;R73－35+2

A

1673－5412(2013）02－0097－03

張小杰(1987－），女，碩士在讀，主要從事血液病學(xué)研究。E-mail:z20055610331@163.com

宋永平(1963－），男，教授，主要從事血液病學(xué)研究。E-mail:songyongping@medmail.com

2012－07－17）