薛保銘,楊惟薇,王英輝,黃聞?dòng)?李平陽,張瑞杰,黃 魁

(廣西大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣西 南寧 530004)

磺胺類抗生素是較為重要的一類抗生素藥物,目前已廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè),如牲畜養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)等[1].近年來,我國學(xué)者針對(duì)一些重點(diǎn)漁業(yè)海域,如環(huán)渤海[1-3]、長江三角洲[4]和珠江三角洲[5-7]等地區(qū),開展了抗生素污染研究,結(jié)果表明,抗生素的環(huán)境污染問題嚴(yán)重.

欽州灣是廣西北部灣發(fā)展的重點(diǎn)港灣,也是我國的重要漁場.欽州灣由內(nèi)灣(茅尾海)、灣頸和外灣三部分組成,中間狹窄、兩端開闊,呈啞鈴狀,是個(gè)典型的溺谷型半封閉式海灣.內(nèi)灣既是河口灣,又具備相當(dāng)?shù)姆忾]條件,水交換能力較弱,污染物不易擴(kuò)散[8].欽州灣北部有欽江、茅嶺江等淡水匯入,餌料充足,魚類資源豐富,水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá).近年來,隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,大量抗生素輸入到水體環(huán)境中,然而至今未見欽州灣抗生素污染方面的研究報(bào)道.本文以磺胺類抗生素為研究對(duì)象,揭示欽州灣近海和入海河流磺胺類抗生素濃度水平和分布特征,并對(duì)磺胺類抗生素污染進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,以期為欽州灣海域環(huán)境污染防治工作提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀,串聯(lián)Agilent 6410Triple Quad(三重四級(jí)桿)質(zhì)譜儀;渦旋震蕩器;超聲波清洗器;低速離心機(jī);Supelco SPE Manifolds 12孔固相萃取裝置;CNWBOND HLB固相萃取小柱(500mg,6mL).

回收率指示劑：13C3-咖啡因溶液,濃度為1mg/mL,購自美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室.甲醇為色譜純,購自Merck公司(達(dá)姆施塔特,德國).5種抗生素包括磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基異惡唑(SMX)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺噻唑(STZ)和甲氧芐胺嘧啶(TMP).抗生素均為固體粉末標(biāo)樣,并購自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,密蘇里州,美國).TMP抗菌譜和磺胺類抗生素相近,并且通常作為SAs的增效劑,以1：5的比例施用,因此,本研究將TMP與SAs共同討論.

圖1 欽州灣采樣點(diǎn)示意Fig.1 The sampling sites in the Qinzhou Bay

1.2 樣品采集及預(yù)處理

2010年 10月,課題組采用全球衛(wèi)星定位系統(tǒng)(GPS)定位,在欽州灣近海及入海河流(包括欽江、茅嶺江、金鼓江和大風(fēng)江)共采集水樣34件,其中表層海水樣品為 31件;入海河流水樣為 13件,采樣點(diǎn)地理坐標(biāo)見圖 1.所有海水樣品均在漁船上采集,而入海河流樣品則在橋上采集.海水和河水樣品都采用不銹鋼桶采集,采樣深度為表層下 0～50cm,河流的采樣位置設(shè)置在水流中心.樣品采集完畢后,迅速轉(zhuǎn)移至已洗凈并潤洗 3次的5L棕色玻璃瓶中,并盡快運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,保存在4℃冰箱里待測.

樣品預(yù)處理采用徐維海[9]、張瑞杰等[1]提出的方法進(jìn)行.量取海水樣品 2L(河水樣品為 1L),靜置后通過 0.45μm 的混合纖維酯微孔濾膜,再加入 0.2g Na2EDTA 和 100ng (100μL×1mg/L)回收率指示劑13C3-咖啡因(CAF),并以3mol/L的硫酸溶液調(diào)節(jié)水樣pH值至3.

HLB萃取小柱在使用前進(jìn)行預(yù)淋洗活化：用甲醇、純凈水分別淋洗3次,每次2mL,最后加入酸化后pH值為3的超純水,加至接近充滿HLB小柱.

連接管路,將樣品和HLB小柱及SPE裝置連接,開啟真空泵,調(diào)節(jié)減壓閥,控制樣品以約10mL/min的流速經(jīng)過HLB小柱.柱富集完成后,用10mL純凈水沖洗HLB柱,真空干燥后,用2mL甲醇洗脫3次,洗脫液接至10mL的玻璃具塞離心管中,在室溫下用柔和氮?dú)獯祾咧两?再用甲醇定容至1mL.用0.2μm針頭式濾膜過濾定容后樣品至 1.5mL棕色進(jìn)樣瓶中,4℃冰箱中保存,盡快進(jìn)行 HPLC-MS/MS分析測樣.如果不能及時(shí)上機(jī)測樣,在氮吹濃縮時(shí)可以先濃縮至1mL左右,儲(chǔ)存于-20℃冰箱中,待上機(jī)測樣前再進(jìn)一步濃縮、定容、過濾,以防止部分抗生素在水相溶液中水解.

1.3 HPLC-MS/MS分析

色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse XRDC18Rapid Resolution HT 50mm×2.1mm,1.8μm液相色譜柱,柱前接 Security GuardTMC18(4.0mm×3.0mm)保護(hù)柱.質(zhì)譜條件：選擇電噴霧離子源(ESI),正離子模式;干燥氣溫度 350℃;干燥氣流速10L/min;毛細(xì)管電壓4500V;MS1與MS2溫度均為 100℃,噴霧針壓力 40Psi;碰撞氣：氮?dú)?多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式.流動(dòng)相：流動(dòng)相 A為5mmol/L醋酸銨和0.1%甲酸混合溶液,流動(dòng)相B 為甲醇,流速 0.3mL/min,進(jìn)樣量 2μL,柱溫 25℃.梯度洗脫進(jìn)行分離,每個(gè)梯度完成后平衡時(shí)間為8min.

1.4 質(zhì)量控制

采用外標(biāo)法對(duì)樣品濃度進(jìn)行定量分析,線性方程濃度范圍由 0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg/L 9個(gè)濃度值組成,其R2值大于0.99 (樣品所測得的濃度均未超過標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍).實(shí)驗(yàn)前測定抗生素回收率：在樣品中加入200ng目標(biāo)化合物(設(shè)置5個(gè)平行樣),4℃保存24h后用相同的方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理和提取.測定其濃度后(扣除空白值),計(jì)算各種抗生素的回收率.結(jié)果表明,抗生素的回收率為 71%～81%,如表 1所示.為了控制實(shí)驗(yàn)過程中人為誤差和實(shí)驗(yàn)室背景影響,分別設(shè)置一個(gè)空白樣和樣品平行樣,并在進(jìn)樣過程中同時(shí)測定固定濃度標(biāo)樣進(jìn)行質(zhì)量控制.取 3倍信噪比為儀器檢出限(0.07～0.18ng/L).

表1 實(shí)驗(yàn)中抗生素的回收率和檢測限Table 1 Recoveries and the limits of detection of selected antibiotics

2 結(jié)果與討論

2.1 欽州灣近?？股氐臐舛人?/h3>

在欽州灣海水樣品中,SMX的檢出率和濃度最高,檢出率達(dá) 100%,濃度范圍為 0.25～9.9ng/L,如表2所示.SMX在欽州灣近海的高檢出率和高濃度與前人在其他水域的研究是一致的[10],這可能是由于SMX物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定,不易降解和水解所致.TMP在欽州灣海水樣品中的檢出率和含量水平也相對(duì)較高,其檢出率為87%,濃度范圍為n.d.～3.8ng/L.TMP是一種抗生素的增效劑,通常與SMX,SDZ等磺胺類抗生素以1：5的比例配合使用.因此,較大的使用量可能是欽州灣區(qū)域 TMP檢出率和檢出濃度較高的原因.然而,STZ在欽州灣的檢出率和檢出濃度大大低于其他的磺胺類抗生素,其檢出濃度大多在檢測限附近,這很可能是因?yàn)?STZ已被農(nóng)業(yè)部明令禁止用于水產(chǎn)養(yǎng)殖[11].與國內(nèi)外其他海灣相比,欽州灣磺胺類抗生素污染處于較低水平,其濃度水平遠(yuǎn)低于香港維多利亞港[7]、渤海灣[2]、比利時(shí)海岸帶[12]和萊州灣[13],但稍高于煙臺(tái)海灣和黃海[1].

表2 欽州灣水體抗生素濃度Table 2 The concentration of antibiotics in the Qinzhou Bay

2.2 欽州灣匯海河流的抗生素濃度水平與分布特征

與欽州灣近岸海水相似,在欽州灣匯海河流中,SMX和TMP同樣呈現(xiàn)出較高的檢出率和濃度水平.SMX的檢出率和濃度范圍分別為 100%和 n.d.～12ng/L;而 TMP的檢出率和濃度范圍分別為 92%和 n.d.～4.1ng/L.這種相似性,在一定程度上反映了河流輸入是近?？股匚廴镜摹霸础?

欽江是欽州市最大的河流,流經(jīng)欽州市區(qū)的人口密集區(qū),大量的城鎮(zhèn)污水被排放到其中,因此除了STZ未檢出,其余抗生素在欽江均有不同程度的檢出.茅嶺江檢出的抗生素濃度都比較低,最高濃度僅為 6.8ng/L,這可能與茅嶺江水流量大,自凈能力較強(qiáng)有關(guān).金鼓江和大風(fēng)江的水流都匯入欽州外灣,對(duì)于金鼓江來說,檢出的磺胺類抗生素濃度相對(duì)較高,最高達(dá) 9.2ng/L,這很可能與金鼓江的養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)相關(guān).金鼓江主航道上有大量水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)分布,主要有大蠔養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)魚.水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)需要大量的飼料,為防止病害,需使用大量獸用抗生素.一般來說,抗生素由點(diǎn)源到受納水體,其濃度的稀釋系數(shù)通常是數(shù)十到數(shù)百不等[11],然而,金鼓江和大風(fēng)江抗生素的平均濃度僅為欽州灣(受納水體)的 2倍,茅嶺江中抗生素濃度甚至比茅尾海還低,說明欽州灣近海的抗生素污染除了河流輸入之外,還有別的“源”,如水產(chǎn)養(yǎng)殖,近海排污管等.與其他地區(qū)河流相比,研究區(qū)域內(nèi)河流的磺胺類抗生素殘留水平處于中低水平,其濃度水平低于珠江[6],黃浦江[14],但與韓國的靈山河(Youngsan River)[15]和英國的泰恩河(Tyne River)[16]濃度相當(dāng)(表3).

表3 欽州灣磺胺類抗生素濃度水平(ng/L)與其他地區(qū)比較Table 3 Global comparisons of SAs concentrations (ng/L)in the water

2.3 抗生素污染在欽州灣的空間分布

總體上說,欽州灣匯海河流中抗生素濃度比海灣高,除茅嶺江外,其他河流的抗生素濃度均高于對(duì)應(yīng)的匯入海灣(圖2).在4條匯海河流中,欽江的磺胺類抗生素濃度最高(平均 10ng/L,最高14ng/L).如前所述,欽江流經(jīng)欽州市區(qū),經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá),該區(qū)也是研究區(qū)域中人口最密集的地區(qū),說明抗生素污染與經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度人口密集程度也是相關(guān)的.欽州灣近岸海域中,東海岸抗生素的污染程度相對(duì)比西海岸嚴(yán)重,而欽州灣居民區(qū)和經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)是集中分布在東海岸的,這進(jìn)一步說明了經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人為活動(dòng)是影響欽州灣水體抗生素污染程度的重要因素.對(duì)比欽州灣不同海域的污染情況,發(fā)現(xiàn)內(nèi)灣的污染程度要比外灣嚴(yán)重.例如茅尾海、欽州外灣和三娘灣,這 3個(gè)港灣依次由內(nèi)灣向外灣延伸,其抗生素總濃度分布特征為：茅尾海(平均 8.4ng/L,最高 16ng/L)＞欽州外灣(平均 1.9ng/L,最高 6.8ng/L)＞三娘灣(平均 1.4ng/L,最高 2.0ng/L).這種分布規(guī)律主要是由于內(nèi)灣與污染源距離較近,受納的污染物濃度較高,而且內(nèi)灣的水體交換能力相對(duì)較弱,自凈能力相對(duì)較差.

圖2 欽州灣抗生素污染含量分布Fig.2 Distribution of antibiotics in the Qinzhou Bay

2.4 磺胺類抗生素在欽州灣的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

根據(jù)歐盟的技術(shù)指導(dǎo)文件(TGD)中關(guān)于環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的方法[22],藥品殘留在環(huán)境中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)商值(RQs)的大小來評(píng)價(jià).RQs的計(jì)算可以通過污染物的環(huán)境預(yù)測濃度(PEC)或者實(shí)際監(jiān)測濃度(MEC)與預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC)的比值獲得.本研究中,PNEC值是通過從文獻(xiàn)中收集磺胺類抗生素對(duì)一些物種的急性和慢性毒理數(shù)據(jù)求得.毒理數(shù)據(jù)主要來Isidori[23],Kummerer[24]和 Lee[25]等的研究,涉及藻類、浮萍和魚類等多個(gè)物種.基于最壞情況考慮,本研究中風(fēng)險(xiǎn)商值(RQs)的計(jì)算是通過磺胺類抗生素的最大實(shí)際監(jiān)測濃度與最敏感物種的PNEC值進(jìn)行計(jì)算求得.按照 Hernand等[26]提出的 RQs的分類方法表征生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的不同程度： RQs＜0.1為最低風(fēng)險(xiǎn),0.1≤RQs＜1 為中等風(fēng)險(xiǎn),RQs≥1 為高風(fēng)險(xiǎn).

生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)果表明(圖 3),大部分磺胺類抗生素在欽州灣近海水體環(huán)境中構(gòu)成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)處于較低水平(RQs＜0.01).但在欽州灣4條匯海河流中(茅尾海、茅嶺江、金鼓江和欽江),SMX對(duì)水藻(Synechococcus leopoliensis)的風(fēng)險(xiǎn)商(RQs)值都大于0.1,即存在中等生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn).因此磺胺類抗生素在欽州灣環(huán)境中的污染不容忽視.

圖3 欽州灣4種抗生素的風(fēng)險(xiǎn)商值Fig.3 The RQs of 4 antibiotics in the Qinzhou Bay

3 結(jié)語

4種磺胺類抗生素和TMP在欽州灣近海及4條匯海河流中均有不同程度的檢出,其濃度范圍為 n.d.～12ng/L,均值 5.84ng/L.其中,SMX 在近海和河流的檢出率最高,均達(dá)100%;TMP次之,在河流和海灣的檢出率分別為92%和87%;而STZ最低(在海水中的檢出率僅為 14%).欽州灣匯海河流的抗生素含量普遍高于海灣;海灣中抗生素污染程度隨離岸距離的增加而減少.近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖是欽州灣區(qū)域磺胺類抗生素污染的重要來源.總體上說,與國內(nèi)外其他水域相比,欽州灣海水中磺胺類抗生素濃度處于較低水平.但 SMX的殘留對(duì)相應(yīng)的敏感生物存在中等生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)引起有關(guān)部門的重視并采取相應(yīng)防范措施.

[1] 張瑞杰.黃渤海區(qū)域及東江流域環(huán)境中典型抗生素污染研究[D]. 廣州：中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所, 2011.

[2] Zou S C, Xu W H, Zhang R J, et al. Occurrence and distribution of antibiotics in coastal water of the Bohai Bay, China： Impacts of river discharge and aquaculture activities [J]. Environ. Pollut.,2011,159：2913-2920.

[3] Zhang R J, Tang J H, Li J, et al. Antibiotics in the offshore waters of the Bohai Sea and the Yellow Sea in China： Occurrence,distribution and ecological risks [J]. Environ. Pollut., 2013,174：71-77.

[4] Yan C X, Yang Y, Zhou J L, et al. Antibiotics in the surface water of the Yangtze Estuary： Occurrence, distribution and risk assessment [J]. Environ. Pollut., 2013,175：22-29.

[5] Yang J F, Ying G G., Zhao J L, et al. Spatial and seasonal distribution of selected antibiotics in surface waters of the Pearl Rivers, China [J]. J. Environ. Sci. Health B., 2011,46：272-280.

[6] Xu W H, Zhang G, Zou S C, et al. Determination of selected antibiotics in the Victoria Harbour and the Pearl River, South China using high-performance liquid chromatographyelectrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. Environ.Pollut., 2007,145：672-679.

[7] Minh T B, Leung H W, Loi I H, et al. Antibiotics in the Hong Kong metropolitan area： ubiquitous distribution and fate in Victoria Harbour [J]. Mar. Pollut. Bull., 2009,58：1052-1062.

[8] 劉敬合,葉維強(qiáng).廣西欽州灣地貌及其沉積特征的初步研究 [J].海洋通報(bào), 1989,8(2)：49-57.

[9] 徐維海.典型抗生素藥物在珠江三角洲水環(huán)境中的分布、行為與歸宿 [D]. 廣州：中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所, 2007.

[10] Zheng Q, Zhang R J, Wang Y H, et al. Occurrence and distribution of antibiotics in the Beibu Gulf, China： Impacts of river discharge and aquaculture activities [J]. Mar. Environ. Res.,2012,78：26-33.

[11] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第 627號(hào)[Z]. 2006-03-14.

[12] Wille K, Noppe H, Verheyden K, et al. Validation and application of an LC-MS/MS method for the simultaneous quantification of 13pharmaceuticals in seawater [J]. Analy. Bioanalyt. Chem.,2010,397：1797-1808.

[13] Zhang R J, Zhang G, Zheng Q, et al. Occurrence and risks of antibiotics in the Laizhou Bay, China： impacts of river discharge[J]. Ecotox. Environ. Safe., 2012,80：208-215.

[14] Jiang L, Hu X L, Yin D Q, et al. Occurrence, distribution and seasonal variation of antibiotics in the Huangpu River, Shanghai China [J]. Chemosphere, 2011,82：822-828.

[15] Kim S D, Choa J, Kima I S, et al. Occurrence and removal of pharmaceuticals and endocrine disruptors in South Korean surface, drinking, and waste waters [J]. Water Res., 2007,41：1013-1021.

[16] Roberts P H, Thomas K V. The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewater effluent and surface waters of the lower Tyne catchment [J]. Sci. Total Environ., 2006,356：143-153.

[17] Tamtam F, Mercier F, Le-Bot B, et al. Occurrence and fate of antibiotics in the Seine River in various hydrological conditions[J]. Sci. Total Environ., 2008,393：84-95.

[18] Wiegel S, Aulinger A, Brockmeyer R, et al. Pharmaceuticals in the river Elbe and its tributaries [J]. Chemosphere, 2004,57：107-126.

[19] Managaki S, Murata A, Takada H, et al. Distribution of macrolides, sulfonamides, and trimethoprim in tropical waters：Ubiquitous occurrence of veterinary antibiotics in the Mekong Delta [J]. Environ. Sci. Technol., 2007,41：8004-8010.

[20] Kolpin D W, Furlong E T, Meyer M T, et al. Pharmaceuticals,hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000： A national reconnaissance [J]. Environ. Sci.Technol., 2002,36：1202-1211.

[21] Thomas K V, Hilton M J. The occurrence of selected human pharmaceutical compounds in UK estuaries [J]. Mar. Pollut. Bull.,2004,49：436-444.

[22] EC (European Commission), 2003. European Commission Technical Guidance Document in Support of Commission Directive 93//67/EEC on Risk Assessment for New Notified Substances and Commission Regulation (EC) no. 1488/94on Risk Assessment for Existing Substance, Part II. In： Commission, E.(Ed.), pp. 100-103.

[23] Isidori M, Lavorgna M, Nardelli A, et al. Toxic and genotoxic evaluation of six antibiotics on non-target organisms [J]. Sci.Total Environ., 2005,346：87-98.

[24] Kummerer K, Henninger A. Promoting resistance by the emission of antibiotics from hospitals and households into effluent [J]. Clin.Micro. Infect., 2003,9：1203-1214.

[25] Lee Y J, Lee S E, Lee D S, et al. Risk assessment of human antibiotics in Korean aquatic environment [J]. Environ. Toxicol.Chem., 2008,26：216-221.

[26] Hernando M D, Mezcua M, Fernandez-Alba A R, et al.Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments [J]. Talanta,2006,69：334-342.

致謝：本研究在采樣及測試過程中得到唐建輝、張瑞杰、薛瑞、伍婷婷等人的幫助和支持,在此表示感謝.