許星鴻,張雁秋,閻斌倫,劉艷晴,陳 松,黃福林,唐 瑤 (1.中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院,江蘇 徐州 1008；.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇 連云港 005)

亞硝態(tài)氮是氨氧化成硝態(tài)氮的中間產(chǎn)物,是反映水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)之一[1].在集約化養(yǎng)殖系統(tǒng)中,由于養(yǎng)殖密度和投餌量的加大,積累的殘餌,代謝廢物等有機物往往造成養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮濃度的升高,嚴(yán)重影響?zhàn)B殖對象的生理代謝功能[2-3].日本蟳(Charybdis japonica)廣泛分布于我國各海區(qū),為經(jīng)濟價值較高的海產(chǎn)蟹類[4].許星鴻等[5]就亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳免疫相關(guān)指標(biāo)的影響進(jìn)行了研究,但迄今尚未見有關(guān)亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳消化酶和同工酶影響的報道.消化酶活力的高低直接反映了機體對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力,進(jìn)而影響到機體的存活與生長,而同工酶是生物體代謝的調(diào)節(jié)者,可以呈現(xiàn)機體代謝的一些變化.本文研究了亞硝態(tài)氮脅迫下,日本蟳肝胰腺消化酶活力的變化規(guī)律以及對同工酶表達(dá)的影響,旨在探討亞硝態(tài)氮對日本蟳的毒性作用,為人工養(yǎng)殖的水質(zhì)調(diào)控及相關(guān)毒理學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

日本蟳于2011年11月購自連云港市贛榆縣海濱,采用生態(tài)閉路循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng) 7d,鹽度25,pH8.0,水溫 15℃,自然光照,連續(xù)充氣,一日投喂2次鮮活貝類.選擇附肢完整,活力強且大小相近者用于實驗.甲長為(5.85±0.51)cm,甲寬為(7.69±0.62)cm,體質(zhì)量為(94.22±22.37)g.

1.2 實驗梯度設(shè)置

亞硝態(tài)氮源為亞硝酸鈉,為國產(chǎn)分析純.根據(jù)預(yù)實驗所得亞硝酸鈉對日本蟳的半致死濃度(96h-LC50為75.34mg/L)以及養(yǎng)殖水體通常的亞硝態(tài)氮污染濃度[3],亞硝酸鈉濃度設(shè) 7組:對照組(0mg/L),0.15,0.3,2,5,10,20mg/L,每組設(shè) 3 個平行,每個平行隨機取22只蟹,飼養(yǎng)7d.水溫,投餌,充氣等養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同.每日定時換水2次,并維持各組亞硝酸鈉質(zhì)量濃度.于實驗0,0.5,1,3, 5,7d,每個平行隨機取 3只蟹,置冰盤內(nèi)解剖,取出肝胰腺,保存于-80℃待測消化酶活力.于實驗第7d,分別取對照組和高濃度(20mg/L)組的鰓,肌肉,肝胰腺,胃,心臟,卵巢,精巢等組織,-80℃保存?zhèn)溆糜谕っ笇嶒?

1.3 樣品制備

取上述樣品,以1:5(W/V)加入0.1mol/L預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(pH7.0),冰浴研磨勻漿 5min,取部分肝胰腺勻漿液直接用于測定脂肪酶活力,其余勻漿液用高速冷凍離心機(0～1℃)以 10000r/min的轉(zhuǎn)速離心 30min,取上清液用于其他消化酶或同工酶檢測.

1.4 檢測方法

蛋白酶活力測定采用福林－酚法[6],淀粉酶和纖維素酶活力測定分別采用淀粉－碘顯色法和 3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法[7],脂肪酶活力測定采用 NaOH滴定法[8].樣品蛋白含量采用南京建成生化試劑盒測定.

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行同工酶檢測,濃縮膠濃度為 4%,分離膠濃度為 10%,樣品在濃縮膠中時的電壓為 80V,進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)整為 120V,4℃下電泳.同工酶顯色方法參照毛盛賢[9]的方法.

1.5 數(shù)據(jù)分析

酶活力數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,進(jìn)行單因子方差分析(One-Way ANOVA),LSD(Least Significant Difference)多重比較和Duncan檢驗.顯著水平設(shè)為0.05.顯色固定后的凝膠用美國伯樂ChemDoc XRS型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,本文所有電泳圖譜上方為陰極,下方為陽極,各酶譜的酶帶根據(jù)其相對遷移率Rf由大到小編號,即自陽極方向的酶帶開始依次編號為1,2,3…….

2 結(jié)果

2.1 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺消化酶活力的影響

2.1.1 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影響 由表 1可見,亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力的影響基本表現(xiàn)為“先誘導(dǎo)后抑制”.在處理0.5d時,除20mg/L組外,其他實驗組酸性蛋白酶活力均受到不同程度的誘導(dǎo),以5mg/L組誘導(dǎo)程度最為顯著.隨著脅迫時間的延長,0.15和0.3mg/L兩組酸性蛋白酶活力于第5d升至最高,2mg/L組酸性蛋白酶活力最大值出現(xiàn)于第3d,而脅迫濃度5mg/L及以上的處理組酸性蛋白酶活力均在脅迫第1d升至最高,隨后出現(xiàn)下降.至處理 7d時,高濃度(10,20mg/L)處理組酸性蛋白酶活力顯著低于對照組(P＜0.05).

觀察特定時間的效應(yīng)-劑量關(guān)系,可發(fā)現(xiàn)處理0.5d時,脅迫濃度5mg/L以下的處理組酸性蛋白酶活力與劑量濃度之間存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.913, P＜0.05).處理7d時,脅迫濃度2mg/L及以上的處理組酸性蛋白酶活力與劑量濃度之間則呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.972,P＜0.05).

表1 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺酸性蛋白酶活力(U/mg蛋白)的影響Table 1 Effect of nitrite stress on acid protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.2 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺堿性蛋白酶活力的影響 從表 2可看出,在亞硝態(tài)氮脅迫下,堿性蛋白酶活力在不同的劑量濃度下表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律:在5mg/L及以下的處理組,堿性蛋白酶活力表現(xiàn)為“先誘導(dǎo)后抑制”,誘導(dǎo)程度以0.3mg/L組最為顯著;10mg/L組堿性蛋白酶活力表現(xiàn)為“先抑制后誘導(dǎo)再抑制”;而 20mg/L組堿性蛋白酶活力在處理 0.5d時,受抑制程度較大,雖然在處理1d時有小幅回升,但隨后呈持續(xù)下降趨勢.至處理7d時,脅迫濃度5mg/L及以上的處理組堿性蛋白酶活力低于對照組(P＜0.05).

觀察某一時間的效應(yīng)-劑量關(guān)系,0.3mg/L及以上的實驗組在處理第5d和第7d時,堿性蛋白酶活力與劑量濃度間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01).

表2 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺堿性蛋白酶活力(U/mg 蛋白)的影響Table 2 Effect of nitrite stress on alkali protease activity(U/ mg pro.)of hepatopancreas in Charybdis japonica

2.1.3 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺脂肪酶活力的影響 由表3可知,在亞硝態(tài)氮脅迫下,各實驗組脂肪酶活力均呈現(xiàn)“先誘導(dǎo)后抑制”的變化規(guī)律,誘導(dǎo)程度以10mg/L組最大,在0.5d時,其脂肪酶活力升高至對照組的1.4倍.5mg/L及以下的實驗組脂肪酶活力于脅迫 1d時升至最大,而10,20mg/L兩組最高值出現(xiàn)于處理 0.5d,隨后呈下降趨勢.至處理7d時,2mg/L及以下的實驗組脂肪酶活力高于對照組,而 10,20mg/L兩組脂肪酶活力顯著低于對照組(P＜0.05).

在亞硝態(tài)氮脅迫對脂肪酶的效應(yīng)與劑量關(guān)系方面,濃度10mg/L以下的短期脅迫(0.5d和1d)下,脂肪酶活力與劑量濃度間呈正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.946(P＜0.01)和 r=0.831(P＜0.05).而脅迫濃度2mg/L及以上的實驗組在處理第5d和第7d時,堿性蛋白酶活力與劑量濃度間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為:r=-0.957(P＜ 0.05)和r=-0.993(P＜0.01).

表3 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺脂肪酶活力(×10-3U/mg蛋白)的影響Table 3 Effect of nitrite stress on lipase activity of hepatopancreas(×10-3U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.1.4 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響基本上表現(xiàn)為抑制(表4).2mg/L及以上的實驗組淀粉酶活力持續(xù)下降,于處理5d后趨于平穩(wěn),顯著低于對照組(P＜0.05).

在實驗期間,淀粉酶活力與劑量濃度間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01).

2.2 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳同工酶的影響

表4 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺淀粉酶活力的影響(U/mg 蛋白)Table 4 Effect of nitrite stress on amylase activity of hepatopancreas(U/ mg pro.)in Charybdis japonica

2.2.1 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳 α-淀粉酶 α-AMY同工酶的影響 如圖 1所示,在對照組中,α-AMY 同工酶在鰓中顯示出 3條酶帶:α-AMY-1,α-AMY-2 和 α-AMY-3;在肝胰腺中顯示出2條酶帶:α-AMY-1和α-AMY-2;而在肌肉,卵和胃中僅表達(dá)出α-AMY-1活性.3條酶帶活性強弱依次為:α-AMY-1＞α-AMY-2＞α-AMY-3,α-AMY-1在不同組織中的表達(dá)活性依次為:肝胰腺＞胃＞肌肉＞卵＞鰓.在亞硝態(tài)氮脅迫下,各處理組 α-AMY活性均有所下降,其中鰓處理組僅表達(dá)1條酶帶α-AMY-1,肝胰腺處理組酶帶數(shù)量未減少,但活性減弱.

2.2.2 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳乳酸脫氫酶LDH同工酶的影響 LDH同工酶在日本蟳肌肉,卵子,精子和心臟中均表達(dá)出1條酶帶(圖2),酶帶活性強弱依次為:肌肉＞精子＞心臟＞卵.在亞硝態(tài)氮脅迫下,各處理組 LDH 表達(dá)均有所減弱,以卵處理組LDH活性最低.

2.2.3 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳蘋果酸脫氫酶MDH同工酶的影響 由圖3可見,MDH同工酶共表達(dá)出7條酶帶,其中MDH-1,MDH-4和MDH-7在肌肉,卵,精子,鰓和心臟中均有表達(dá),而 MDH-2,MDH-3,MDH-5和MDH-6的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性:MDH-2在鰓中不表達(dá);在卵和精子中表達(dá)MDH-3,但未表達(dá) MDH-5;MDH-6僅在鰓中有微弱表達(dá).在亞硝態(tài)氮脅迫下,肌肉處理組 MDH-1活性有所下降,MDH-5和MDH-7兩條酶帶消失,但新增兩條酶帶:MDH-2和MDH-4,且活性較強;鰓處理組MDH-1活性比對照組略強;其他各處理組MDH同工酶均出現(xiàn)活性下降甚至酶帶消失現(xiàn)象.

圖1 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳淀粉酶α-AMY同工酶的影響Fig.1 Effect of nitrite stress onα-amylase isozymes of Charybdis japonica

圖2 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳乳酸脫氫酶LDH同工酶的影響Fig.2 Effect of nitrite stress on lactate dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

圖3 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳蘋果酸脫氫酶MDH同工酶的影響Fig. 3 Effect of nitrite stress on malic dehydrogenase isozymes of Charybdis japonica

2.2.4 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳過氧化物酶POD同工酶的影響 從圖4可看出,對照組POD同工酶的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的組織特異性:肌肉和鰓均表達(dá) POD-4和 POD-6;肝胰腺表達(dá) POD-5和POD-6;心臟表達(dá) 4條酶帶:POD-2,POD-3,POD-4和POD-6;除POD-4以外的5種POD同工酶在卵中均有表達(dá).在本實驗高濃度(20mg/L)亞硝態(tài)氮脅迫 7d后,除肝胰腺處理組的 POD-6有微弱表達(dá)外,其他各處理組均未檢測到POD同工酶活性.

圖4 亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳過氧化物酶POD同工酶的影響Fig.4 Effect of nitrite stress on peroxidase isozymes of Charybdis japonica

3 討論

3.1 環(huán)境脅迫對甲殼動物消化酶活力的影響

甲殼動物消化酶活力是反映其消化生理機能的重要指標(biāo),環(huán)境因素能通過改變消化酶活力而影響到機體的生長甚至生存.王維娜等[10]報道水體中適量的金屬離子可激活日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)消化道中胃蛋白酶和類胰蛋白酶的活性,高濃度時則有抑制作用.徐武杰等[11]研究表明三疣梭子蟹(Portunus trituverculatus)在氨氮(1,5,20mg/L)脅迫下消化酶活力呈現(xiàn)明顯的峰值變化,至24h和48h時趨于穩(wěn)定,肝胰腺胃蛋白酶和脂肪酶活力與氨氮脅迫濃度呈正相關(guān),而淀粉酶活力與劑量濃度呈明顯負(fù)相關(guān).Antoine等[12]研究發(fā)現(xiàn)歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)在濃度為 0.53～16.11mg/L的氨氮慢性脅迫下飼料轉(zhuǎn)化率隨著氨氮濃度升高而升高.本實驗中,較低濃度(≤10mg/L)的亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳肝胰腺消化酶活力產(chǎn)生一定的誘導(dǎo)效應(yīng),而高濃度(20mg/L)的亞硝態(tài)氮脅迫對堿性蛋白酶和淀粉酶活力表現(xiàn)出明顯的抑制效應(yīng),與上述環(huán)境脅迫對甲殼動物消化酶活力的影響規(guī)律相近.

研究表明環(huán)境脅迫會導(dǎo)致甲殼動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),生理代謝發(fā)生較大的變化,如耗氧量增大,能量需求增加以及免疫相關(guān)酶活力升高等[13-14].Stebbing[15]把這種在毒物作用下生物酶出現(xiàn)的增益現(xiàn)象稱為“毒物興奮效應(yīng)”.一定濃度亞硝態(tài)氮脅迫下,日本蟳消化酶活力的升高可提高機體對餌料的消化能力,利于補償因應(yīng)激反應(yīng)所增加的能量消耗.但是當(dāng)亞硝態(tài)氮超過一定的閾值或者長期處于脅迫條件下,日本蟳的溶菌酶等免疫酶活力會出現(xiàn)顯著下降[16].在本實驗中處理 7d時,脅迫濃度2mg/L及以上的實驗組各消化酶活力與劑量濃度間均呈明顯負(fù)相關(guān),表明亞硝態(tài)氮的過度脅迫會顯著影響到機體的消化功能.

3.2 環(huán)境脅迫對甲殼動物同工酶表達(dá)的影響

同工酶是廣泛存在于生物體同一種屬或同一生物不同組織器官,由不同基因位點或等位基因編碼的多肽鏈的單體,純聚體或雜聚體,能催化相同化學(xué)反應(yīng),但其理化或生物性質(zhì)不同的酶,可作為基因表達(dá)的分析工具[9].本實驗中日本蟳不同組織的α-AMY,LDH,MDH和POD等4種同工酶的表達(dá)均表現(xiàn)出明顯的組織特異性,與宋微微等[17]的研究結(jié)果相一致,其中關(guān)于日本蟳POD同工酶的表達(dá)分析屬首次報道.

王蘭等[18-19]報道高濃度的鎘脅迫對河南華溪蟹(Sinopotamon henanense)POD同工酶以及中華絨螯蟹(Eriocheir siensises)酯酶EST同工酶均表現(xiàn)出明顯的抑制作用.俞亞東等[20]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的銅和鋅都會導(dǎo)致羅氏沼蝦鰓中超氧化物歧化酶 SOD條帶變窄,顏色變淡.本實驗中,高濃度亞硝態(tài)氮的脅迫對日本蟳的α-AMY,LDH, MDH和POD等同工酶表達(dá)均表現(xiàn)出一定的抑制作用.LDH與運動供能相關(guān),MDH是三羧酸循環(huán)中催化蘋果酸和草酰乙酸相互轉(zhuǎn)變的酶,其含量能影響糖的有氧氧化反應(yīng)的進(jìn)行及ATP的合成[17].而POD是抗氧化功能酶,能催化由過氧化氫參與的各種還原劑的氧化反應(yīng),可與SOD協(xié)同作用清除生物體在逆境脅迫下產(chǎn)生的大量自由基[21].α-AMY,LDH,MDH和 POD等同工酶的活性降低表明機體的消化,能量代謝及抗氧化功能等均受到影響.高濃度亞硝態(tài)氮脅迫下,日本蟳肌肉中新增兩條活性較強的酶帶(MDH-2和MDH-4)可能與機體處于逆境中能量消耗大,代謝負(fù)荷加重有關(guān).關(guān)于較低程度的環(huán)境脅迫對日本蟳同工酶表達(dá)的影響尚需進(jìn)一步研究.

國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中未對亞硝態(tài)氮濃度有明確要求,但一些地方標(biāo)準(zhǔn)提出了水質(zhì)中亞硝態(tài)氮的上限濃度,如舟山市海洋與漁業(yè)局水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定亞硝酸鈉濃度≤0.3mg/L,而崇明農(nóng)業(yè)網(wǎng)推薦養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽濃度以≤0.15mg/L為宜.本研究表明,日本蟳在 0.15,0.3mg/L的亞硝態(tài)氮脅迫 7d后,消化酶活力基本上無顯著變化,表明低濃度的亞硝態(tài)氮脅迫對日本蟳消化功能未造成明顯影響.濃度在2mg/L及以上的亞硝態(tài)氮脅迫導(dǎo)致日本蟳消化酶的活力顯著降低,20mg/L的高濃度亞硝態(tài)氮脅迫可造成日本蟳同工酶表達(dá)的活性減弱,表明亞硝態(tài)氮的過度脅迫會顯著影響機體的消化,能量代謝及免疫等功能,可能會導(dǎo)致疾病暴發(fā),這在養(yǎng)殖生產(chǎn)中值得注意.

4 結(jié)語

日本蟳消化酶活力可被低濃度(0.15,0.3mg/L)的亞硝態(tài)氮脅迫所誘導(dǎo),且在處理7d時,仍保持在較高的水平;較高濃度(2,5,10mg/L)亞硝態(tài)氮的短期脅迫(0.5～1d)會誘導(dǎo)酸性蛋白酶,堿性蛋白酶和脂肪酶活力的迅速升高后又快速下降;而高濃度(20mg/L)的亞硝態(tài)氮脅迫顯著抑制日本蟳消化酶活力和同工酶表達(dá).

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