黨 巖,張 瑞,葉杰旭,艾 晗,孫德智*

(1.北京林業(yè)大學(xué)水體污染源控制技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100083；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310032)

垃圾焚燒作為城市生活垃圾減量化、無害化、資源化的一個(gè)有效手段,近年來得到越來越廣泛的應(yīng)用.由于我國城市生活垃圾廚余物多,含水率高,在焚燒過程中會(huì)產(chǎn)生大量的滲瀝液[1],需要收集后集中處理.垃圾焚燒滲瀝液成分復(fù)雜,C O D相比于垃圾填埋場(chǎng)滲濾液更高(＞70000mg/L)[2],同時(shí)還含有高鹽度、高氨氮、多種難降解物質(zhì)(如腐殖酸等),處理難度大[1,3].厭氧生物處理具有處理效率高、能耗低、運(yùn)行成本低等優(yōu)點(diǎn),國內(nèi)外普遍采用膨脹顆粒污泥床(EGSB)等厭氧生物處理工藝處理垃圾填埋場(chǎng)滲濾液[4-6].但是,對(duì)于垃圾焚燒滲瀝液的處理并不多見.垃圾滲瀝液微生物種群在很大程度上決定了反應(yīng)器的運(yùn)行狀況.通過研究垃圾焚燒滲瀝液處理工藝超負(fù)荷運(yùn)行前后的微生物群落結(jié)構(gòu)變化能夠全面掌握工藝處理效率降低的機(jī)理,指導(dǎo)工藝的穩(wěn)定運(yùn)行.

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室小試EGSB反應(yīng)器處理垃圾焚燒廠滲瀝液,考察了反應(yīng)器有機(jī)負(fù)荷對(duì)COD去除率以及出水揮發(fā)酸(VFAs)含量的影響,最終超負(fù)荷狀態(tài)下運(yùn)行11d,并對(duì)超負(fù)荷運(yùn)行前后的厭氧顆粒污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究.

1 材料與方法

1.1 EGSB反應(yīng)器的運(yùn)行

實(shí)驗(yàn)室小試EGSB反應(yīng)器由有機(jī)玻璃加工而成,有效容積4L(圖1).內(nèi)徑60mm,主反應(yīng)區(qū)高徑比為12：1.內(nèi)回流系統(tǒng)使主反應(yīng)區(qū)內(nèi)的液體上升流速保持在1.8m/h,反應(yīng)器運(yùn)行溫度維持在(33±1)°C.接種污泥取自河南某實(shí)際處理啤酒廢水的UASB反應(yīng)器,MLVSS/MLSS為0.72.接種污泥量為6.4g MLVSS/L.

圖1 EGSB反應(yīng)器裝置示意Fig.1 Schematic diagram of the lab-scale EGSB reactor

1.2 試驗(yàn)用水與工藝運(yùn)行條件

試驗(yàn)用水采用北京市某垃圾焚燒發(fā)電廠滲瀝液,其主要水質(zhì)特點(diǎn)如表1所示.實(shí)驗(yàn)進(jìn)水采用垃圾滲瀝液與自來水根據(jù)需要按一定比例混合,并儲(chǔ)存于4℃冰箱中.進(jìn)水COD從5000mg/L開始逐漸提高,在反應(yīng)器運(yùn)行第1～56d水力停留時(shí)間 (HRT)保持在2.5d,第57～67d,以垃圾滲瀝液原水為進(jìn)水,為調(diào)整反應(yīng)器有機(jī)負(fù)荷,HRT延長至3d.

表1 垃圾焚燒滲瀝液主要水質(zhì)特點(diǎn)Table 1 Characteristics of leachate from MSW incineration plant

1.3 分析項(xiàng)目及方法

COD的測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法,pH值的測(cè)定采用Thermo Orion 3-Star pH測(cè)定儀.水樣中的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸等的測(cè)定采用氣相色譜法(氣相色譜儀,Agilent 7890)配置Agilent HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30m,0.53mm,1.0μm)和氫火焰檢測(cè)器(FID),測(cè)定條件參考Bertin等[7]的方法.

1.4 厭氧顆粒污泥樣品與總DNA的提取

在EGSB反應(yīng)器運(yùn)行至第56,67d時(shí),從反應(yīng)器主反應(yīng)區(qū)中下部取出少量顆粒污泥,用于DNA的提取.總DNA的提取,采用滾珠震蕩機(jī)械破碎法[8]對(duì)顆粒污泥進(jìn)行破碎,根據(jù)Omega公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒說明書對(duì)總DNA進(jìn)行提取.提取純化后的DNA經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定,2個(gè)樣品A260/A280值分別為1.798和1.773,說明提取的DNA純度較好.

1.5 PCR的擴(kuò)增及克隆文庫的構(gòu)建

以總DNA為模板,分別以細(xì)菌和古菌的通用引物 27F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 和109F/915R(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′/5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTT-3′)對(duì)其細(xì)菌和古菌進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增,用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,將目的條帶切膠回收并純化.

將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy載體(Promega)上,然后轉(zhuǎn)化到高效率感受態(tài)細(xì)胞JM109中.在 LB/氨芐/IPTG/X-Gal培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)18h.經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆子,并通過引物T7/SP6進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定.

利用限制性內(nèi)切酶對(duì)陽性克隆轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切分類.對(duì)于細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增片段采用Rsa I和Msp I,對(duì)于古菌的16S rRNA基因擴(kuò)增片段采用Rsa I和Taq I[9].在3%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,以了解每個(gè)克隆子中所含微生物片段的類型,并整合分類.

對(duì)插入質(zhì)粒載體的目的DNA片段測(cè)序(中美泰和生物技術(shù)公司),將所得序列中相似度大于97%的序列歸類為一個(gè)操縱子(OTUs),不同的OTU用BLAST程序在NCBI的Genbank上搜索相似序列,確定樣品中所含微生物所屬的種類范疇,通過MEGA(version 5)軟件繪制neighbor-joining系統(tǒng)發(fā)育樹.用Bootstrap評(píng)估樹的穩(wěn)定性.

2 結(jié)果與討論

2.1 EGSB反應(yīng)器的運(yùn)行

由圖2可見,反應(yīng)器運(yùn)行第1～56d,進(jìn)水COD從大約5000mg/L逐漸提高到約55000mg/L,HRT保持在2.5d,有機(jī)負(fù)荷從2.1kgCOD/(m3·d)逐漸提升到23.1kgCOD/(m3·d).COD去除率在第7d時(shí)就提升到了90%以上,之后一直維持在93%以上.這一階段中COD平均去除率達(dá)到94.82%,出水中VFAs含量(圖3)一直低于350mg/L,反應(yīng)器內(nèi)pH7.4～7.8,說明這一階段反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定,處理效果良好.在反應(yīng)器運(yùn)行第57～67d,進(jìn)水COD提升至大于70000mg/L,延長HRT至3.0d,有機(jī)負(fù)荷提升至 24.5kgCOD/(m3·d).這一階段,COD去除率持續(xù)下降,第67d下降至73.9%.同時(shí),出水中VFA含量迅速升高至約10000mg/L,其中以丙酸和乙酸為主(圖3),反應(yīng)器內(nèi)pH值下降至6.8.說明此階段反應(yīng)器處于超負(fù)荷狀態(tài)運(yùn)行,大量VFAs積累導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)酸化現(xiàn)象.

2.2 克隆文庫構(gòu)建和微生物群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)反應(yīng)器超負(fù)荷運(yùn)行前后2個(gè)時(shí)期的厭氧顆粒污泥樣品(第56,67d樣品,分別定義為樣品A和B)進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)的克隆文庫分析.古菌和細(xì)菌分別選取了約80個(gè)和140個(gè)陽性克隆子構(gòu)建克隆文庫.經(jīng)菌落PCR、酶切分類、測(cè)序后,獲得了樣品A和B的微生物群落結(jié)構(gòu)(表2).

圖2 EGSB反應(yīng)器的運(yùn)行Fig.2 Performance of the EGSB reactor

圖3 出水中VFA含量的變化Fig.3 Variation of VFAconcentrations in the effluent

表2 污泥樣品A和樣品B的克隆統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table2 Cloneresultsof microbein sludgesampleA andB

對(duì)于樣品A,反應(yīng)器在超負(fù)荷運(yùn)行前,代表古菌的12個(gè)OTUs的79個(gè)克隆子被分為4類古菌：產(chǎn)甲烷髦毛菌(Methanosaetaceae)、產(chǎn)甲烷桿菌(Methanobacteriaceae)、產(chǎn)甲烷微菌(Methanomicrobiaceae)和產(chǎn)甲烷八疊球菌(Methanosarcinaceae),其優(yōu)勢(shì)菌群是產(chǎn)甲烷髦毛菌,含量為68.4%.古菌中豐度最高的克隆子A3(29/79)也屬于產(chǎn)甲烷髦毛菌,它與Methanosaeta concilii(CP002565)的序列相似性為99%,M.concilii可以利用小分子有機(jī)酸形成甲烷并且與厭氧顆粒污泥的形成有關(guān)[10],保障了EGSB反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行.在產(chǎn)甲烷古菌中產(chǎn)甲烷髦毛菌與產(chǎn)甲烷八疊球菌屬于乙酸營養(yǎng)型甲烷菌,是厭氧產(chǎn)甲烷反應(yīng)器中的最重要的古菌,乙酸營養(yǎng)型甲烷菌的含量的多少直接決定了厭氧反應(yīng)器運(yùn)行效果[11].

樣品A的細(xì)菌中,代表23個(gè)OTUs的131個(gè)克隆子被分為5類細(xì)菌：低GC革蘭氏陽性菌(Firmicutes)、高 GC革蘭氏陽性菌(Actinobacteria)、δ-變形菌、ε-變形菌、綠彎菌門(Chloroflexi),其中優(yōu)勢(shì)菌群是低GC革蘭氏陽性菌,含量為56.5%,高GC革蘭氏陽性菌含量為19.8%,是第2優(yōu)勢(shì)菌.細(xì)菌的菌群豐富度相比于一些以自配水為進(jìn)水的厭氧生物反應(yīng)器低很多[9,12],主要是由于垃圾滲瀝液中存在多種毒性物質(zhì)及生物抑制性物質(zhì)所導(dǎo)致的[3].樣品A取樣時(shí),EGSB反應(yīng)器以進(jìn)水COD約55000mg/L,有機(jī)負(fù)荷約23 kgCOD/(m3·d)穩(wěn)定運(yùn)行10d,COD平均去除率94.1%,說明在此負(fù)荷下,EGSB反應(yīng)器可以穩(wěn)定運(yùn)行(樣品A的系統(tǒng)發(fā)育樹沒有給出).

樣品B,其微生物群落結(jié)構(gòu)與樣品A相比發(fā)生了明顯的變化.對(duì)于古菌,優(yōu)勢(shì)菌群變?yōu)楫a(chǎn)甲烷微菌,其含量為51.9%,第2優(yōu)勢(shì)菌群是產(chǎn)甲烷桿菌,其含量為36.7%.產(chǎn)甲烷微菌和產(chǎn)甲烷桿菌均是氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌,其總含量達(dá)到了88.6%.而在A樣品中處于古菌優(yōu)勢(shì)地位的產(chǎn)甲烷髦毛菌的含量降低至8.9%,另一類乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)甲烷八疊球菌的含量依舊很低,僅為2.5%.乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌含量的降低導(dǎo)致小分子有機(jī)酸(如乙酸、丙酸等)不能被迅速利用,造成有機(jī)酸的大量積累,反應(yīng)器出現(xiàn)酸化現(xiàn)象.產(chǎn)甲烷古菌的生長周期較長,一般需要十幾天到幾十天[13],而本研究中反應(yīng)的超負(fù)荷運(yùn)行11d,沒有充足的時(shí)間使產(chǎn)甲烷古菌大量繁殖,古菌菌群中乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌含量的大幅度降低是由于產(chǎn)甲烷髦毛菌在超負(fù)荷狀態(tài)下大量死亡所導(dǎo)致的.

對(duì)于樣品B的細(xì)菌,代表12個(gè)OTUs的136個(gè)克隆子被分為2大類：低GC革蘭氏陽性菌和高GC革蘭氏陽性菌,其含量分別為56.6%和43.4%.而在樣品A中存在的屬于δ-變形菌、ε-變形菌和綠彎菌門的菌在樣品B中均沒有檢出.說明超負(fù)荷狀態(tài)下,屬于這些菌群的細(xì)菌的生長均受到了抑制.細(xì)菌中,豐度最高的操縱子OTU 2(40/136)屬于高 GC革蘭氏陽性菌,它與Atopobiumsp.ICM42b10(HQ616393)的序列相似度達(dá)100%.Atopobium是一種產(chǎn)酸菌,其代謝產(chǎn)物一般為乳酸或丙酸[14],它的大量存在導(dǎo)致反應(yīng)器中丙酸大量產(chǎn)生.樣品B中的低GC革蘭氏陽性菌中,幾乎全部的克隆子都屬于Clostridiales,Clostridiales的很多子分支的菌種都是厭氧生物反應(yīng)器中很常見的菌,其中有很多是產(chǎn)乙酸菌,同時(shí)Clostridiales普遍具有能產(chǎn)生芽孢的生物特性,以抵御惡劣的生存環(huán)境[15].樣品B的古菌及細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4,圖5所示.

2.3 討論

本研究的工藝處理垃圾焚燒廠滲瀝液在有機(jī)負(fù)荷為23.1kgCOD/(m3·d)時(shí)已接近反應(yīng)器所能承受的有機(jī)負(fù)荷上限.同時(shí),進(jìn)水中的氨氮負(fù)荷、鈣負(fù)荷、毒性物質(zhì)濃度等也可能是引起反應(yīng)器超負(fù)荷運(yùn)行的原因[16].由反應(yīng)器超負(fù)荷前后微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況可以看出,反應(yīng)器在比較短的時(shí)間內(nèi)(11d),古菌和細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)都發(fā)生了明顯變化,有較多的菌群在超負(fù)荷運(yùn)行狀態(tài)下不能繼續(xù)生存,嚴(yán)重影響了反應(yīng)器的處理效果.同時(shí),由于垃圾滲瀝液的生物抑制作用,厭氧顆粒污泥的微生物種群多樣性較低,相對(duì)簡單的種群結(jié)構(gòu)抗沖擊能力較差,更容易受到外界環(huán)境變化帶來的影響.

圖4 樣品B的古菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of archaea in sludge sample B

圖5 樣品B的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of eubacteria in sludge sample B

一般厭氧顆粒污泥對(duì)有機(jī)物的降解性能下降有2種原因：一是污泥中微生物的生物活性受到抑制導(dǎo)致的,二是污泥中微生物死亡導(dǎo)致的.由于古菌的生長周期較長,如果反應(yīng)器處理效果的下降是由于古菌的大量死亡導(dǎo)致的,恢復(fù)反應(yīng)器的運(yùn)行效果則需要很長的時(shí)間[5].反應(yīng)器內(nèi)VFAs的含量是衡量反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)的直觀且迅速的指標(biāo),為防止反應(yīng)器進(jìn)入超負(fù)荷運(yùn)行狀態(tài)時(shí)間過長導(dǎo)致污泥中功能微生物的大量死亡,應(yīng)密切注意出水VFAs的含量變化.

克隆文庫法對(duì)混合菌群的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行考察存在一定的誤差,比如由于克隆文庫中克隆子數(shù)量的因素帶來的偶然誤差.在實(shí)驗(yàn)條件允許情況下,可以適當(dāng)增加克隆子數(shù)量,減少偶然誤差.

3 結(jié)論

3.1 采用EGSB工藝處理垃圾焚燒滲瀝液在有機(jī)負(fù)荷低于23.1kgCOD/(m3·d)時(shí)COD去除率較高,平均達(dá)94.82%.進(jìn)一步提高有機(jī)負(fù)荷,反應(yīng)器進(jìn)入超負(fù)荷狀態(tài),COD去除率顯著降低.

3.2 反應(yīng)器超負(fù)荷運(yùn)行前后,在較短時(shí)間內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化.古菌的優(yōu)勢(shì)菌群從產(chǎn)甲烷髦毛菌(68.4%)變?yōu)楫a(chǎn)甲烷微菌(51.9%);細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌一直是低GC革蘭氏陽性菌,且大多數(shù)屬于Clostridiales目,具有形成芽孢的特性以抵御嚴(yán)格的生長環(huán)境.

3.3 反應(yīng)器超負(fù)荷運(yùn)行時(shí)出現(xiàn)的COD去除率下降以及出水VFA大量增高是由于乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的大量死亡導(dǎo)致的,甲烷髦毛菌的含量在超負(fù)荷運(yùn)行前后的含量從68.4%降低至8.9%,產(chǎn)甲烷八疊球菌的含量一直低于3%.

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