楊寶田，周 瑜，李學(xué)龍

（沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034）

基于線粒體16SrRNA基因徂徠林蛙（R.culaiensis）與鎮(zhèn)海林蛙（R.zhenhaiensis）的物種分化

楊寶田，周 瑜，李學(xué)龍

（沈陽(yáng)師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110034）

目前對(duì)徂徠林蛙的描述僅限形態(tài)學(xué)分析，對(duì)其與近緣物種的分化及物種有效性尚缺乏分子生物學(xué)研究。筆者對(duì)徂徠林蛙所屬長(zhǎng)肢林蛙種組物種及其他林蛙屬物種的線粒體16S r RNA基因部分序列進(jìn)行分析，得到序列長(zhǎng)度521bp。遺傳變異分析顯示徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙以及峨眉林蛙遺傳距離很近（均為0.9%），表明徂徠林蛙在進(jìn)化過(guò)程中是一個(gè)緊密連接鎮(zhèn)海林蛙與峨眉林蛙的物種。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙構(gòu)成姐妹群，徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙處于物種分化過(guò)程中的并系階段，其物種分化還未完全完成。

16S rDNA；徂徠林蛙；鎮(zhèn)海林蛙；物種分化

0 引 言

林蛙（brown frog）隸屬于兩棲綱（Amphibian）無(wú)尾目（Anura）蛙科（Ranidae）林蛙屬（Rana）［1］。中國(guó)的林蛙屬物種共16種，其中包括近年發(fā)表的新種貓兒山林蛙（R.maoershanensis）［2］、徂徠林蛙（R.culaiensis）［3］和R.jiemuxiensis［4］，可劃分為3個(gè)種組［5］。徂徠林蛙僅分布于山東徂徠山，隸屬長(zhǎng)肢林蛙種組（R.longicrus species group），曾被視為鎮(zhèn)海林蛙（R.zhenhaiensis）［6］，Li et al.（2008）通過(guò)對(duì)比其與鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙的形態(tài)學(xué)特征，將其定為新種。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，采用DNA序列分析探討物種的分化，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)已成為系統(tǒng)學(xué)和分類學(xué)中不可缺少的組成部分。動(dòng)物線粒體基因表現(xiàn)為母系遺傳，因其分子量小、進(jìn)化速度快［7］等特性被廣泛地用于親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析、分子地理演化和系統(tǒng)發(fā)育研究。應(yīng)用線粒體DNA進(jìn)行遺傳分化和物種有效性研究在林蛙屬物種中已得到廣泛應(yīng)用［8－9］。Li et al.（2008）在新種描述中僅將徂徠林蛙與其他林蛙在形態(tài)學(xué)上進(jìn)行了比較分析，尚缺少分子生物學(xué)證據(jù)。本研究應(yīng)用線粒體16S r RNA基因部分序列對(duì)徂徠林蛙與其他長(zhǎng)肢林蛙種組物種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析，探討它們之間的遺傳分化和系統(tǒng)演化關(guān)系，進(jìn)而為徂徠林蛙的分類地位及物種有效性提供分子生物學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和DNA提取

本文采用Frost（2011）的分類學(xué)命名規(guī)則。共對(duì)本實(shí)驗(yàn)室采集的5個(gè)徂徠林蛙樣本的16S r RNA基因進(jìn)行了測(cè)序，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的寒露林蛙和中國(guó)林蛙序列［9］以及在GenBank收集的數(shù)據(jù)［10－13］進(jìn)行了分析。其中作為內(nèi)群的有長(zhǎng)肢林蛙種組物種：徂徠林蛙（R.culaiensis）、寒露林蛙（R.hanluica）、鎮(zhèn)海林蛙（R.zhenhaiensis）、峨眉林蛙（R.omeimontis）和昭覺(jué)林蛙（R.chaochiaoensis），以及中國(guó)林蛙（R.chensinensis），張村蛙（R.zhengi），R.sauteri，R.shuchinae，R.johnsi。選擇側(cè)褶蛙屬（Pelophylax）的黑斑側(cè)褶蛙（P.nigromaculata）與Lithobates屬的L.catesbeiana做為外群（表1）。采集的5個(gè)徂徠林蛙樣品為肝臟組織，保存于濃度為95%的乙醇溶液中，－20℃冰箱保存。肝臟樣品總DNA提取采用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提的方法［14］。

表1 樣本及16S rRNA基因序列信息

1.2 DNA擴(kuò)增、序列測(cè)定和分析

用于擴(kuò)增mt DNA 16S r RNA基因的引物為F51（5'CCCGCCTGTTTACCAAAAACA3'）（Moritzet al.，1992）和R51（5'GGTCTGAACTCAGATCACGTA3'）［15］。PCR擴(kuò)增在ABI 9700型擴(kuò)增儀上完成。反應(yīng)總體積為25μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行94℃變性30s、46℃退火30s、72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物交由北京六合華大基因有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，以確保序列的準(zhǔn)確性。采用Lasergene 7.10軟件拼接雙向測(cè)得的序列，用CLUSTAL［16］進(jìn)行序列比對(duì)，并輔以手工編輯。用DnaSP 4.00［17］進(jìn)行單倍型分析，采用MEGA 5.0［18］軟件計(jì)算Kimura雙參數(shù)遺傳距離。

以P.nigromaculata和L.catesbeiana為外群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。ML樹(shù)用RAx ML 7.0.4軟件［19］完成，同時(shí)進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣的bootstrap分析，檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)的置信度。ML樹(shù)的最佳模型為（GTR＋G）由Mr Modeltest 2.3［20］軟件分析得出。用Mega 5.0［18］，基于Kimura雙參數(shù)模型，用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行1000次重復(fù)抽樣的bootstrap分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 林蛙屬物種16S rRNA基因序列及變異

所有27個(gè)樣品16S r RNA基因，經(jīng)過(guò)比對(duì)編輯，得到有效序列長(zhǎng)度為521bp。共檢測(cè)到107個(gè)可變位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的20.53%。插入和缺失位點(diǎn)數(shù)共26個(gè)。使用Mega 5.0中的Kimura雙參數(shù)法計(jì)算這內(nèi)群物種遺傳距離（表2）。中國(guó)林蛙屬物種遺傳變異范圍處于0.9%～8.4%，物種間平均遺傳距離為5.5%，徂徠林蛙與其他林蛙物種的遺傳變異為0.9%～7.1%。其中徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙遺傳距離最?。ň鶠?.9%），峨眉林蛙與鎮(zhèn)海林蛙的遺傳距離為1.8%。

表2 林蛙屬物種16S rRNA基因部分序列Kimura's two-parameter遺傳距離

2.2 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

用鄰接法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）分別對(duì)所收集到林蛙物種做分子系統(tǒng)發(fā)育分析，P.nigromaculata和L.catesbeiana作為外群。兩種分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)大致相似，所以選擇ML樹(shù)為例（圖1）。從分子系統(tǒng)樹(shù)中可以看出，徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙各自組成了自己?jiǎn)为?dú)的支系并構(gòu)成姐妹群再與峨眉林蛙構(gòu)成的單系群聚合。雖然徂徠林蛙所在支系的單系性支持度較低（NJ，41／ML，56），但徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙的節(jié)點(diǎn)支持度很高（NJ，95／ML，84）。由徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙、峨眉林蛙、寒露林蛙和長(zhǎng)肢林蛙構(gòu)成的長(zhǎng)肢林蛙種組也得到了支持（NJ，81／ML，94）。

圖1 線粒體16S rRNA基因部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，枝上的數(shù)字分別為節(jié)點(diǎn)的NJ樹(shù)自舉值／ML樹(shù)自舉值

3 討 論

林蛙（特別是長(zhǎng)肢林蛙種組）是一個(gè)復(fù)雜的類群。鎮(zhèn)海林蛙是由葉昌媛等（1995）從日本林蛙（R.japonica）中分離并命名的物種，分布于中國(guó)東南部的浙江、福建、安徽、江西、江蘇、湖南、廣東和廣西等地。有研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)海林蛙也間斷性的分布于華北地區(qū)的天津薊縣和山東徂徠山兩個(gè)局部地區(qū)［21－23］，但對(duì)于此曾受到部分學(xué)者的質(zhì)疑［6］。Liet al.（2008）經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)比較研究，認(rèn)為山東徂徠山的林蛙與鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙均存在差異，將其定為一新種——徂徠林蛙（R.c u l a i e n s i s）［3］。

線粒體16S r RNA基因是研究種內(nèi)或近緣種間系統(tǒng)發(fā)育和演化問(wèn)題常用的工具之一，并且其序列差異被廣泛用于林蛙屬物種研究［9，13］。本研究在對(duì)中國(guó)林蛙屬物種遺傳距離分析中，徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙的遺傳距離均為0.9%（表2），而鎮(zhèn)海林蛙與峨眉林蛙的遺傳距離為1.8%。徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙3個(gè)物種間的遺傳距離顯示，徂徠林蛙是一個(gè)在遺傳進(jìn)化方面連接鎮(zhèn)海林蛙與峨眉林蛙的中間物種。在由線粒體16S r RNA基因部分序列構(gòu)建的NJ樹(shù)和ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和峨眉林蛙構(gòu)成了一個(gè)進(jìn)化支（支持率NJ，81／ML，79），3種林蛙系統(tǒng)地位很近。徂徠林蛙樣本構(gòu)成的單系群自舉值支持率不高（NJ，41／ML，56），但其與鎮(zhèn)海林蛙構(gòu)成的單系群的節(jié)點(diǎn)支持率很高（NJ，95／ML，84），說(shuō)明徂徠林蛙是一個(gè)既有別于鎮(zhèn)海林蛙又具很近親緣關(guān)系的物種。

遺傳變異、自然選擇和隔離是物種形成的3個(gè)主要因素。達(dá)爾文認(rèn)為，漸進(jìn)式物種形成是物種分化的主要方式。該方式在物種內(nèi)部分異之初，某種（或幾種）自然物理因素阻礙種群間基因交流，從而使得種群間遺傳差異逐步增大，經(jīng)過(guò)若干中間階段，最后達(dá)到種群間完全的生殖隔離和新種形成。在這里，環(huán)境因素造成的隔離是漸進(jìn)式物種形成的必要條件，而環(huán)境阻隔本身也有一個(gè)形成和發(fā)展的漸進(jìn)過(guò)程，并且可能與被分隔種群間遺傳差異的積累協(xié)同進(jìn)行。研究推測(cè)，徂徠林蛙和鎮(zhèn)海林蛙的祖先種分布區(qū)很廣，由于自然環(huán)境因素的作用某些種群呈現(xiàn)間斷性分布且相距較遠(yuǎn)，這就形成了一定地理隔離，地理隔離使這些種群之間的基因交流出現(xiàn)障礙。由于棲息地環(huán)境的差別及長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果，隔離種群逐步在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)了一個(gè)新的生態(tài)位。同時(shí)，兩棲動(dòng)物的擴(kuò)散能力較差又加劇了祖先種群間基因交流的阻遏作用。

結(jié)合形態(tài)學(xué)方面（頭長(zhǎng)、頭寬、眼直徑和鼓膜直徑等）的對(duì)比研究結(jié)果［3］，初步認(rèn)為徂徠林蛙是一個(gè)介于鎮(zhèn)海林蛙與峨眉林蛙之間的中間物種，并與鎮(zhèn)海林蛙有更近親緣關(guān)系。該物種屬漸進(jìn)式物種形成的鄰域型物種演化途徑［24］，與鎮(zhèn)海林蛙處于物種分化過(guò)程中的并系階段［25］，從某種程度上說(shuō)徂徠林蛙的物種分化還未完全完成。

4 結(jié)論與建議

1）徂徠林蛙是一個(gè)在遺傳進(jìn)化方面連接鎮(zhèn)海林蛙與峨眉林蛙的中間物種，與鎮(zhèn)海林蛙親緣關(guān)系密切；

2）徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙處于物種分化過(guò)程中的并系階段，其物種分化還未完全完成；

3）本研究?jī)H使用了線粒體16r RNA基因部分序列進(jìn)行分析，有必要選擇更多基因片段，特別是核基因做進(jìn)一步更深入研究。

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Species differentiation ofR.culaiensisandR.zhenhaiensisbased on partial sequences of mitochondrial 16S r DNA

YANG Baotian，ZHOU Yu，LI Xuelong

（College of Chemistry and Life Science，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，China）

Rana culaiensisfound in Mt.Culai in Shandong，China was reported as a new species just based on morphological analysis；there are no molecular data about the phylogenetic relationships and speciation process for this frog.The partial sequences（521bp）of 16S r RNA gene from 25specimens of the brown frog species distributed in China and Japan were analyzed.The nucleotide sequence divergence betweenR.culaiensisandR.zhenhaiensiswas 0.9%，as well as betweenR.culaiensisandR.omeimontis.The phylogenetic relationships based on NJ and ML indicated thatR.culaiensisandR.zhenhaiensisconstitute a sister group.It is suggested thatR.culaiensiswas closely related toR.zhenhaiensis，and the speciation ofR.culaiensisare in paraphyletic stage and not completed.

16S rDNA；R.culaiensis；R.zhenhaiensis；species differentiation

Q38

A

10.3969／j.issn.1673-5862.2013.02.003

1673-5862（2013）02-0143-05

2013-03-07。

國(guó)家林業(yè)局全國(guó)第二次陸生野生動(dòng)物資源調(diào)查項(xiàng)目；沈陽(yáng)師范大學(xué)第十批校級(jí)重點(diǎn)課程建設(shè)項(xiàng)目；沈陽(yáng)師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心主任基金資助項(xiàng)目（SY200902）。

楊寶田（1963-），男，遼寧沈陽(yáng)人，沈陽(yáng)師范大學(xué)副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師。