張 艷，王 福，喬志燕，梅立新，溫海玲，陳志宏△

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

2型糖尿病是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用形成的多基因遺傳性復(fù)雜疾病，可直接引起肝臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷。肝臟是貯存糖原的重要器官，糖代謝過程中某些酶活性的變化將導(dǎo)致肝糖原的含量發(fā)生變化。多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，高血糖動(dòng)物模型肝臟糖原含量下降，經(jīng)典降糖西藥二甲雙胍可通過增加糖原合成等作用降低血糖[1];許多降血糖的中藥也可通過增加肝糖原含量發(fā)揮降血糖的作用[2]。蠶繭提取物—絲膠是一種由18種氨基酸組成的高分子水溶性蛋白，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，并對(duì)糖尿病血糖升高具有一定的預(yù)防作用[3]。本研究通過觀察絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影響，探討絲膠降血糖作用的機(jī)制及對(duì)肝糖原儲(chǔ)備的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，臨時(shí)用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%的溶液。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。RM2125 RT切片機(jī)，德國(guó)Leica公司;BH-2型OLYMPUS顯微鏡及攝像裝置，日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組與處理 清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào):712024)，體重200-250g。將大鼠隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、糖尿病模型組、絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組、絲膠預(yù)防組，每組12只。模型組、絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠均采用2% STZ(25mg/kg，3d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動(dòng)物模型，一周后以血糖≥16.7mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)。待模型成功建立后，模型組大鼠不做任何處理;絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d)連續(xù)灌胃35d;陽(yáng)性對(duì)照組大鼠給予二甲雙胍(55.33mg/kg/d)連續(xù)灌胃，時(shí)間同絲膠治療組。絲膠預(yù)防組大鼠于連續(xù)注射STZ(25mg/kg)前給予絲膠(2.4g/kg/d)灌胃35d。

1.3 檢測(cè)血糖 各組大鼠禁食12h以上，4%水合氯醛腹腔注射，成功麻醉后，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，京立LD4-2A離心機(jī)3000r/min離心20min，收集血清，應(yīng)用日立公司全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)血糖。

1.4 肝糖原含量的檢測(cè)及定量分析 大鼠取血后斷頭處死，取肝臟，置于Bouins液固定，常規(guī)石蠟包埋。Leica石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，片厚5μm，行過碘酸雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)染色。切片脫蠟后，入95%乙醇60min，1%過碘酸氧化液40μl染色5-10min;蒸餾水洗后滴加Schiff試劑20μl，染色10-15min;棄掉玻片上多余的Schiff試劑后，滴加0.5%偏重亞硫酸鈉50μl，連續(xù)3次，每次間隔1-2min;流水沖洗后蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照采用淀粉酶消化處理組織切片;以胞漿出現(xiàn)紫紅色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對(duì)PAS染色陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析:每組隨機(jī)選取6只大鼠，每只大鼠選取10張肝組織切片，每張切片在10×40倍顯微鏡下選取視野，計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物面積占視野面積的比值，取平均值作為肝糖原含量的相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠血糖的影響 模型組大鼠的血糖水平明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組、絲膠預(yù)防組大鼠的血糖水平均明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01);且絲膠治療組、絲膠預(yù)防組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無明顯差別(P＞0.05)。見附表。結(jié)果表明，絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖水平。

2.2 絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠肝糖原含量的影響 各組大鼠肝臟切片均可見PAS法肝糖原陽(yáng)性產(chǎn)物，為紫紅色顆?；蚣?xì)膩顆粒片狀聚集，位于肝細(xì)胞胞漿。糖尿病模型組大鼠肝糖原的含量明顯低于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.01);絲膠治療組、陽(yáng)性對(duì)照組、絲膠預(yù)防組大鼠肝糖原的含量均明顯高于糖尿病模型組大鼠(P＜0.01)，且絲膠治療組、絲膠預(yù)防組與陽(yáng)性對(duì)照組比較無明顯差別(P＞0.05)。見附表。結(jié)果表明，絲膠可明顯增加2型糖尿病大鼠肝糖原的含量。

附表 各組大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

附表 各組大鼠的血糖和肝糖原含量(±s，n=12)

與糖尿病模型組比較:*P＜0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組比較:#P＞0.05

組別 血糖(mmol/L)肝糖原(面積百分比)正常對(duì)照組 10.83±2.03* 24.33±1.73*糖尿病模型組 29.45±4.82 12.21±2.27絲膠治療組 13.20±4.09*# 21.26±1.62*#陽(yáng)性對(duì)照組 13.18±2.30* 21.18±1.39*絲膠預(yù)防組 10.04±2.29*# 23.81 ±2.71*#

3 討論

高血糖作為糖尿病的基本病理特征，也是引起慢性并發(fā)癥的重要原因，嚴(yán)格控制糖尿病患者的血糖水平，是避免引起糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵。肝臟可通過促進(jìn)糖原合成、葡萄糖利用及抑制糖異生等途徑降低血糖，是糖代謝的主要器官。肝臟的糖代謝作用主要在胰島素的誘導(dǎo)下完成，胰島素能夠抑制內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生以及刺激外周組織攝取葡萄糖，通過激活糖原合成酶磷酸酶，使糖原合成酶去磷酸化，從而提高糖原合成酶的活性，促進(jìn)糖原的合成[4-6]。糖尿病時(shí)，胰島素對(duì)葡萄糖的氧化和非氧化作用的刺激均受損，其中非氧化受損明顯，肝糖原合成作為葡萄糖非氧化代謝的重要組成部分受到顯著影響[7]。四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰島素水平明顯降低，肝臟糖代謝紊亂，糖原合成降低、葡萄糖利用減少、糖異生加強(qiáng)，導(dǎo)致血糖升高[8-9]。本研究亦證實(shí)了這一點(diǎn)，糖尿病模型組大鼠肝糖原明顯減少，提示糖尿病大鼠肝細(xì)胞合成糖原的功能可能由于胰島素作用的減弱而受到損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠可顯著降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，增加肝臟肝糖原的含量，表明絲膠可通過增加肝糖原的合成改善機(jī)體的高血糖狀態(tài)，其作用效果與陽(yáng)性藥物二甲雙胍接近。由此推測(cè)，增加肝糖原含量可能是絲膠降血糖作用的機(jī)制之一，但增加肝糖原含量可能不是絲膠降血糖作用的唯一機(jī)制。因此，要全面了解絲膠降血糖的作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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