楊昌宇，劉開俊

擠壓傷(crush injury)是一種常見的創(chuàng)傷，多見于自然災(zāi)害、交通事故和戰(zhàn)傷，病死率極高。擠壓傷死亡原因在急性期主要是低血容量休克和高血鉀癥［1］。在后期，急性腎功能衰竭、多器官功能衰竭綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)和膿毒癥為最重要致死因素［2］。研究表明，骨骼肌受到長(zhǎng)時(shí)間擠壓時(shí)，損傷貫穿于整個(gè)缺血期和再灌注期。而缺血期和再灌注期損傷都與大量Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度改變，形成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載有關(guān)［3］。

目前關(guān)于擠壓傷研究大都是針對(duì)受損器官的保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)旨在建立擠壓傷動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用鈣離子阻滯劑鹽酸維拉帕米注射液(異搏定)，通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生，探討鈣離子阻滯劑對(duì)擠壓傷的保護(hù)作用。本研究目的不是探討對(duì)受損傷器官的作用，而是主要針對(duì)減少代謝毒性物質(zhì)氧自由基和減少代謝毒性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)對(duì)全身?yè)p害作用。

材料與方法

1 材料

1.1 主要試劑和藥物 丙二醛測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)、冰醋酸(廣州新港化工廠)、異博定(上海禾豐制藥有限公司)、戊巴比妥鈉(武漢合中醫(yī)藥化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠40只，體重190～250g(購(gòu)至同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.3 主要儀器 PE聚乙烯導(dǎo)管(美國(guó)健康醫(yī)療儀器國(guó)際公司)、紫外可見分光光度計(jì)uv-3600(日本島津)、全自動(dòng)生化分析儀(日本島津)、恒溫水浴箱(武漢科學(xué)儀器廠)、低速離心機(jī)LD4-2型(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、微量式移液器(北京明力普瑞科技有限公司)、漩渦混合儀(步海瀘西分析儀器廠)、加熱攪拌器(深圳Bio-Tek科學(xué)儀器廠)、普通光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUSTOKYO)、醫(yī)用凈化超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鼠頸外靜脈持久性置管 用1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，常規(guī)無(wú)菌操作。于頸中線偏左側(cè)，切開皮膚，解剖并游離左頸外靜脈，結(jié)扎頸外靜脈遠(yuǎn)端，將導(dǎo)管插入頸外靜脈，深約2.5～3.0cm，用絲線結(jié)扎固定。將頸部導(dǎo)管引至項(xiàng)部皮膚下露出體外并固定，用于給藥和取血。

2.2 大鼠擠壓傷模型的建立 采用Akimau的方法，將大鼠俯臥于1塊12cm×9cm×1cm木板上，重量約3.0kg。大鼠四肢分別固定與木板四角鐵制的固定桿上。用2塊帶槽的木塊固定兩側(cè)大腿，保護(hù)股骨不致被壓斷，3.5kg鉛塊由上至下均勻擠壓，持續(xù)擠壓 6h［4］。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 40只大鼠隨機(jī)分為4組，分別為:(1)對(duì)照組(A):不擠壓動(dòng)物并注射生理鹽水1ml/kg/h;(2)一般治療組(B):在擠壓時(shí)至解壓后3h僅注射生理鹽水1ml/(kg·h);(3)早期鈣離子阻滯劑(calcium channel blocker，CCB)異博定治療組(C):擠壓后當(dāng)即輸注異搏定2mg/kg及輸注生理鹽水1ml/(kg·h)至解壓后3h;(4)解壓后CCB異搏定治療組(D):擠壓時(shí)和解壓后注射生理鹽水1ml/(kg·h)，并在解壓后5min內(nèi)開始輸注異搏定2mg/kg治療。

2.4 血清肌酸激酶(CK)的測(cè)定 分別在解壓前5min、解壓后3h通過(guò)頸外靜脈導(dǎo)管抽血各取全血標(biāo)本1.0ml，3000r/min離心15min，生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)血清CK含量。

2.5 血清丙二醛(MDA)的測(cè)定 血清MDA水平檢測(cè)采用硫代巴比妥法 。血清標(biāo)本抽取方法同上。MDA含量測(cè)定按試劑盒操作表制備空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和各測(cè)定管;旋渦混勻器混勻，試管口用聚乙烯薄膜扎緊，用針頭刺1個(gè)小孔;95℃水浴，40min;取出后流水冷卻，3500r/min，離心10min;取上清液，532nm處，1cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值(A532nm)。

血清MDA計(jì)算公式:血清中MDA含量(nmol/ml)=(測(cè)定管吸光度－測(cè)定空白管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光－標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/ml)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

2.6 血清超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定 血清SOD水平檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法 。血清標(biāo)本抽取方法同上，3000r/min離心15min。按試劑盒要求配制各試劑，用旋渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40min。加入顯色劑?；靹?，10min后倒入1cm光徑比色杯中，蒸餾水調(diào)零，波長(zhǎng)550nm處比色。

血清SOD活力計(jì)算公式:SOD活力(U/ml)=(對(duì)照管吸光度－測(cè)定管吸光度)/50% ×反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

2.7 擠壓傷后大鼠活率測(cè)定 4組大鼠解壓3h后拔頸靜脈導(dǎo)管，結(jié)扎插管的頸靜脈，縫合頸部創(chuàng)口后釋放，重新放回籠中提供正常的飲食。從解壓后開始共計(jì)觀察72h，并分別在 12、18、24、36、72h 各時(shí)間段記錄大鼠死亡只數(shù)，以觀察擠壓后72h各組存活率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 擠壓傷各組血清CK水平的變化

各擠壓傷組CK水平明顯增高。但早期使用CCB治療組血清CK水平在各擠壓傷組最低。在解壓后3h，單純擠壓傷組血清CK水平最高，與對(duì)照組及CCB治療各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 擠壓傷后大鼠血清CK水平的變化(±s，u/L)

表1 擠壓傷后大鼠血清CK水平的變化(±s，u/L)

與對(duì)照組比較:▲P＜0.01;與一般治療組比較:●P＜0.01

組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 2066.89±198.64 2065.91±198.64●B組 10 6340.23±299.67▲ 9212.50±567.87 C組 10 4176.72±376.49▲● 6857.58±409.68●D組 10 6340.85±299.69▲ 8318.75±545.98●

2 擠壓傷各組MDA血清水平的變化

擠壓前5min，擠壓傷各組大鼠血清MDA含量升高，與對(duì)照組比較差異有顯著意義。在擠壓傷各組血漿中，早期使用CCB治療組含量最低。與其他擠壓傷組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解壓后3h，在擠壓傷各組大鼠血漿中，一般治療組MDA含量升高最為明顯，解壓后運(yùn)用CCB治療組含量次之，早期使用CCB治療組含量最低。一般治療組MDA含量與其他組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 擠壓傷后大鼠血清MDA水平的變化(±s，nmol/L)

表2 擠壓傷后大鼠血清MDA水平的變化(±s，nmol/L)

與對(duì)照組比較:▲P＜0.01;與一般治療組比較:●P＜0.01

組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 4.14 ±0.33 4.14±0.33●B組 10 7.34±0.24▲ 8.89±0.15 C組 10 5.40±0.46▲● 6.20±0.37●D組 10 7.65±0.55▲ 8.01±0.38●

3 擠壓傷各組血清SOD水平的變化

擠壓各組血清SOD在解壓前5min含量與對(duì)照組比較明顯升高，具有顯著差異。其中早期使用CCB治療組含量最低，與其他擠壓傷組含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。解壓后3h，血漿SOD水平均降低，其中一般治療組血清SOD含量最低，早期使用CCB治療組含量最高，一般治療組血清SOD含量與各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 擠壓傷后大鼠血清SOD水平的變化(±s，u/L)

表3 擠壓傷后大鼠血清SOD水平的變化(±s，u/L)

與對(duì)照組比較:▲P＜0.01;與一般治療組比較:●P＜0.01

組別 例數(shù) 解壓前5min 解壓后3h A組 10 2066.95±199.84 2066.95±198.84●B組 10 6339.15±298.74▲ 9212.51±569.87 C組 10 4177.12±378.41▲● 6858.43±409.73●D組 10 6342.14±299.74▲ 8319.05±545.88●

4 擠壓傷后大鼠存活率

在擠壓傷各組大鼠中，死亡大多數(shù)發(fā)生在24h內(nèi)，約占死亡總數(shù)的81%，死亡原因可能與高血鉀和低血容量休克有關(guān)。一般治療組10只大鼠24h內(nèi)死亡7只(死亡率為70%)，72h內(nèi)死亡8只(死亡率為80%);擠壓后CCB治療組24h內(nèi)死亡5只(死亡率為50%)，72h死亡8只(死亡率為80%);早期運(yùn)用鈣離子阻滯劑組72h死亡例數(shù)僅為2例(死亡率為20%)，見表4。4組總體之間有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0012＜0.01)。早期運(yùn)用鈣離子阻滯劑組死亡例數(shù)與一般治療組比較，有顯著差異(P=0.01)，見圖1。

表4 各組擠壓傷大鼠72h各時(shí)間段死亡例數(shù)

圖1 各治療組大鼠生存曲線的比較

討 論

骨骼肌能耐受輕微的缺血2h，2～4h的缺血可導(dǎo)致不可逆的解剖功能的改變。在缺血期由于肌肉受到機(jī)械擠壓，導(dǎo)致肌細(xì)胞膜牽張感受器，激活離子通道開放，促使Ca2+內(nèi)流。組織灌溉不足和細(xì)胞缺氧使細(xì)胞無(wú)氧代謝增多，三磷酸腺苷(ATP)生成減少，Na+/K+-ATP泵活性降低，造成細(xì)胞內(nèi)Na+排出減少，濃度增高。再灌注后細(xì)胞為了恢復(fù)正常的生理功能，一方面激活Na+/K+-ATP泵，另一方面快速激活Na+/Ca2+交換蛋白，以加快Na+細(xì)胞外流，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時(shí)也將大量Ca2+運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)。血液再灌注時(shí)細(xì)胞為了排出過(guò)多的H+，也通過(guò)Na+/H+交換，使胞外Na+內(nèi)流，而再次通過(guò)Na+/Ca2+交換，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流。缺血再灌注期也可通過(guò)第二信使途徑增加Na+/Ca2+交換，使胞漿Ca2+濃度升高。另一方面，在再灌注時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生的大量的自由基，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，也可促進(jìn)鈣超載的發(fā)生。

肌肉壞死一般發(fā)生在缺血6h［5－6］。肢體較長(zhǎng)時(shí)間受到擠壓時(shí)，受壓部位肌肉內(nèi)的血液供氧發(fā)生障礙，甚至阻斷。組織細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧后，功能下降，甚至壞死，并釋放毒性壞死產(chǎn)物。當(dāng)解壓后，組織細(xì)胞重新獲得血液氧氣供給，損傷應(yīng)隨即停止，但相應(yīng)的組織細(xì)胞功能，代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞更為嚴(yán)重，即出現(xiàn)了缺血再灌注損傷［7］。而缺血再灌注損傷在造成擠壓局部組織細(xì)胞損傷的同時(shí)，更嚴(yán)重的是起其他遠(yuǎn)隔部位臟器的損害［8］。其主要機(jī)制是受擠壓局部組織細(xì)胞的有害物質(zhì)隨血液循環(huán)，影響及損害其他器官組織，嚴(yán)重可造成多個(gè)臟器功能衰竭。

研究表明，骨骼肌細(xì)胞Ca2+的改變是缺血期和再灌注期擠壓組織損傷的主要原因之一。其機(jī)制為在缺血期Ca2+在細(xì)胞內(nèi)大量聚集，從而激活中心蛋白水解酶、Ca2+依賴磷酸激酶、核酸蛋白酶及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)使受壓骨骼肌細(xì)胞變性、壞死、橫紋肌溶解。另一方面，當(dāng)肌肉組織受到擠壓發(fā)生缺血缺氧時(shí)，產(chǎn)生大量一氧化氮和氧自由基。這些自由基可通過(guò)直接攻擊生物大分子，膜通道后增加炎癥細(xì)胞的黏附和游出，脂質(zhì)過(guò)氧化作用等方式造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝障礙［9］。作為自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的醛或終產(chǎn)物之一MDA，毒性作用最大，可使酶等帶有氨基的大分子化合物發(fā)生交聯(lián)，加重了有活性的蛋白質(zhì)變性;同時(shí)也破壞體內(nèi)的核酸和染色體［9］。它的含量反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，可間接反應(yīng)組織受自由基損傷的程度。SOD是一種重要的氧自由基清除劑，他對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，此酶能清除歧化超氧陰離子，其活性高低可反應(yīng)體內(nèi)抗自由基水平、SOD和MDA可間接反應(yīng)自由基代謝水平。肌酸激酶在肌細(xì)胞中含量豐富，當(dāng)肌細(xì)胞損傷時(shí)，其大量進(jìn)入血，其在血清中的水平與肌肉的損傷程度相關(guān)聯(lián)，也是反映肌肉損傷的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清CK、MDA、SOD水平作為反映大鼠受擠壓損傷程度和抗氧自由基指標(biāo)。CCB是一組能夠阻止各種病理因素導(dǎo)致Ca2+細(xì)胞內(nèi)流的藥物，在心血管疾病治療中廣泛應(yīng)用。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CCB可選擇阻斷在缺血缺氧等病理狀態(tài)下的鈣超載，而不影響正常的細(xì)胞鈣平衡［10］。研究表明鈣離子阻滯劑異搏定能減輕大鼠在組織缺血再灌注損傷過(guò)程中脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制鈣離子內(nèi)流，降低組織細(xì)胞的破壞程度［11］。

本研究表明對(duì)照組血清CK、MDA明顯低于其他擠壓傷組血清，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明由于物理擠壓和缺血再灌注損傷促使肌細(xì)胞大量破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)CK和代謝產(chǎn)物MDA大量入血而異常增高。通過(guò)在解壓前和解壓后應(yīng)用CCB治療組血清MDA、CK水平低于一般治療組(P＜0.01)，其中解壓前5minCCB治療組血清CK、MDA明顯低于其他兩擠壓傷組(P＜0.01)，提示CCB不但能夠減輕機(jī)械擠壓對(duì)下肢的損傷，而且對(duì)解壓后缺血再灌注氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷亦有保護(hù)作用(如表1、2)。

而作為氧自由基清除劑SOD在細(xì)胞損傷時(shí)也大量入血，因此在解壓前5min各擠壓傷組明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中早期CCB治療組SOD水平明顯低于其他兩擠壓傷組(P＜0.01)。但解除擠壓后隨著氧自由基的大量消耗，血清 SOD水平 逐漸下降，其中解壓后3h各CCB治療組SOD水平明顯低于一般治療組(P＜0.01)，說(shuō)明CCB能夠通過(guò)減少氧自由基的產(chǎn)生和降低SOD的消耗，從而降低氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，使血清SOD水平可維持較高水平(如表3)。通過(guò)生存分析比較亦發(fā)現(xiàn)早期使用鈣離子阻滯劑干預(yù)組的大鼠，其72h存活率明顯高于單純擠壓傷組(P＜0.01)，其原因可能為減少血液循環(huán)中氧自由基等有害物質(zhì)對(duì)全身?yè)p傷。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)各大鼠擠壓傷組分別對(duì)肌肉損傷的重要指標(biāo)肌酸激酶，反映組織受自由基損傷程度的脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物之一MDA，抗自由基水平氧自由基清除劑SOD血清水平及72h存活率比較，發(fā)現(xiàn)CCB治療組各項(xiàng)結(jié)果明顯優(yōu)于單純治療組。提示鈣離子阻滯劑能夠減輕擠壓傷對(duì)機(jī)體的損傷。其可能機(jī)制為鈣離子阻滯劑通過(guò)阻斷損傷肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流病理過(guò)程，一方面減輕局部骨骼肌的損傷，另一方面減少代謝毒性物質(zhì)和氧自由基進(jìn)入血液循環(huán)對(duì)全身的損害。而生存分析比較提示早期CCB治療組存活優(yōu)于解壓后治療組，說(shuō)明CCB對(duì)擠壓傷的治療應(yīng)及早進(jìn)行。

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