歐維正，駱科文，王 燕，秦 萬，蒙 俊，張廷梅

(貴陽市肺科醫(yī)院，貴州貴陽550003)

目前，用于結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)耐藥性的檢測方法有多種，但大部分檢測方法所需時(shí)間較長。傳統(tǒng)方法是以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對(duì)濃度法和比例法，需要2～3個(gè)月時(shí)間才能得到藥物敏感性結(jié)果，放射性快速診斷技術(shù)(BACTEC)可將耐藥檢測縮短到2～4周，但仍不能滿足臨床的需要。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，MTB基因組的破譯和耐藥分子機(jī)制的闡明，使我們從分子水平上認(rèn)識(shí)了MTB的遺傳本質(zhì)和耐藥機(jī)制，建立了許多先進(jìn)的分子生物學(xué)方法?；蛐酒褪墙臧l(fā)展起來的一種新方法。基因芯片是利用MTB耐藥性與基因突變有關(guān)的分子機(jī)制，對(duì)其與耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測位點(diǎn)的突變情況判斷MTB的耐藥性，將耐藥性檢測的時(shí)間縮短到5～6 h，達(dá)到快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測耐藥性的目的。我們用基因芯片與比例法藥物敏感性試驗(yàn)做比較研究，檢測MTB對(duì)利福平(rifampin，RFP)和異煙肼(isoniazid，INH)的耐藥情況，初步評(píng)價(jià)基因芯片對(duì)快速診斷耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的臨床價(jià)值。

材料和方法

一、材料

1.檢測菌株 收集貴陽市肺科醫(yī)院2011至2012年間327株MTB臨床分離株。比例法藥物敏感性試驗(yàn)以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC 27294)為質(zhì)控菌株。

2.抗結(jié)核藥物 RFP和INH均為Sigma公司產(chǎn)品(批號(hào)分別為080M1506V和060M0090)。

3.培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基、RFP和INH含藥改良羅氏培養(yǎng)基自制。用于比例法藥物敏感性檢測的RFP和INH含藥培養(yǎng)基藥物終濃度分別為 40 和0.2 μg/mL。

4.MTB耐藥基因芯片檢測試劑 由博奧生物有限公司提供［注冊號(hào)為國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2010第 3400383號(hào)，批號(hào)為 20120201和20120601］。檢測指標(biāo)包括RFP及INH的3個(gè)耐藥相關(guān)基因rpoB、katG及inhA啟動(dòng)子的野生型及不同突變型。其中RFP耐藥相關(guān)基因rpoB檢測6個(gè)位點(diǎn)，包括531位 TCG→TTG、531位 TCG→TGG、526位 CAC→GAC、526 位 CAC→TAC、526位 CAC→CTC、526位 CAC→CGC、511位 CTG→CCG、513位 CAA→CCA、513位 CAA→AAA、516位 GAC→GTC、516位 GAC→TAC、516 位 GAC→GGC及533位CTG→CCG等13種突變型，對(duì)于INH耐藥相關(guān)基因katG及inhA啟動(dòng)子各檢測1個(gè)位點(diǎn)，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC2個(gè)突變型，inhA基因啟動(dòng)子-15位C→T突變型。

5.儀器 MTB耐藥基因芯片配套檢測儀器由博奧生物有限公司提供，包括ExtractorTM36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Slide-WasherTM8芯片洗干儀、LuxScanTM10K-B微陣列芯片掃描儀等;TC-96/G/H(b)基因擴(kuò)增儀由杭州博日科技有限公司提供。

二、方法

1.比例法藥物敏感性試驗(yàn) 參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［1］進(jìn)行 MTB臨床分離株的RFP和INH比例法藥物敏感性試驗(yàn)，菌懸液首先配制成1 mg/mL，再稀釋成10-2和10-4mg/mL 2個(gè)濃度，分別接種于RFP和INH含藥改良羅氏培養(yǎng)基上。

2.DNA提取 在進(jìn)行比例法藥物敏感性試驗(yàn)后，用10 μL接種環(huán)刮取(盡量取到斜面各部分)約1/2環(huán)相同菌株按MTB耐藥基因芯片檢測試劑說明書提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.MTB耐藥基因檢測 將提取的DNA按試劑說明書進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增、芯片雜交、洗滌、甩干和結(jié)果掃描判讀。以試劑盒自帶的陰陽性對(duì)照作為質(zhì)控。

4.DNA序列測定 隨機(jī)將基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)的RFP或/和INH結(jié)果不符的16株樣本DNA，委托博奧生物有限公司送第三方進(jìn)行測序。

結(jié) 果

一、經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性鑒定為MTB的臨床分離株，分別用基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)檢測其對(duì)RFP和INH的耐藥性，2011至2012年間共完成327株檢測，其中有31株RFP或/和INH結(jié)果不符，總符合率為90.52%，見表1;二者對(duì)MDR-TB的檢出率分別為18.65%和18.96%。

二、DNA測序的16株MTB結(jié)果對(duì)照基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的突變類型:rpoB515(A→T)、rpoB526(C→A)、rpoB516(G→A)和 rpoB531(TC→CA)，不在基因芯片檢測范圍內(nèi)。其中1株rpoB511(T→C)的突變株同時(shí)檢測有rpoB526(C→A)的突變。DNA測序結(jié)果與基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果比較見表2。

表1 基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)327株MTB耐藥性的檢測結(jié)果比較

表2 基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)檢測結(jié)果不符的16株MTB與DNA測序結(jié)果比較

討 論

我國是世界第2大結(jié)核病高發(fā)國家，也是MDR-TB患者最多的國家［2］。結(jié)核病疫情惡化的原因之一是MDR-TB的出現(xiàn)和流行。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)最新調(diào)查每年有48.9萬例MDRTB患者［3］，而我國9.3%的結(jié)核病患者是MDRTB，幾乎是世界 MDR-TB患病率(4.8%)的2倍［4］。RFP和INH作為結(jié)核病治療中最主要的一線抗結(jié)核藥物，對(duì)其耐藥性的研究日益受到重視，檢測其耐藥性是診斷MDR-TB的依據(jù)。

本研究用基因芯片和比例法藥物敏感性試驗(yàn)檢測MTB對(duì)RFP和INH的耐藥性，基因芯片與傳統(tǒng)的比例法藥物敏感性試驗(yàn)相比，RFP符合率為93.27%，INH符合率為95.11%，RFP和INH的總符合率為90.52%，同時(shí)二者對(duì)MDR-TB的檢出率也基本相同，分別為18.65%和18.96%，顯示2種方法具有極高的可比性。表1顯示，15株比例法藥物敏感性試驗(yàn)RFP敏感株和8株比例法藥物敏感性試驗(yàn)INH敏感株用基因芯片檢測為耐藥，而7株比例法藥物敏感性試驗(yàn)RFP耐藥株和8株比例法藥物敏感性試驗(yàn)INH耐藥株用基因芯片檢測為敏感。為進(jìn)一步研究2種方法的差異，我們從上述31株RFP或/和INH結(jié)果不符菌株中隨機(jī)選出16株菌株做DNA序列測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除3株基因芯片RFP敏感株因3個(gè)新基因突變類型不在檢測范圍內(nèi)而漏檢，1株基因芯片RFP耐藥株合并有其他新基因突變類型外，其余基因芯片結(jié)果均與DNA測序結(jié)果完全符合，特別INH結(jié)果100%符合，反觀比例法藥物敏感性試驗(yàn)與DNA測序結(jié)果比較，符合率≤50.00%。表2結(jié)果提示，基因芯片較比例法藥物敏感性試驗(yàn)與DNA測序的結(jié)果符合率更高。對(duì)于比例法藥物敏感性試驗(yàn)敏感而基因芯片耐藥菌株，可能與比例法藥物敏感性試驗(yàn)的控制條件不良有關(guān)，也可能與某些基因位點(diǎn)突變的低水平耐藥相關(guān)［5］。對(duì)于比例法藥物敏感性試驗(yàn)?zāi)退幎蛐酒舾械木?，除上述有的基因突變類型不在基因芯片檢測范圍內(nèi)外，比例法藥物敏感性試驗(yàn)的控制條件不良也可能是原因之一。

有研究表明，MTB耐RFP是由于其作用靶標(biāo)RNA聚合酶β亞單位的編碼基因(rpoB)突變所致［6-7］，其中96%的RFP耐藥性與rpoB基因81 bp處的突變有關(guān)［5］。耐 INH 與 katG、inhA、ahpC 和kasA中一個(gè)或多個(gè)基因突變有關(guān)［6-7］，其中約有30% ～60%的INH耐藥是katG基因突變引起，少數(shù)INH的低水平耐藥由inhA基因突變所致［5］。Bang等［8］對(duì) 1 825例結(jié)核病患者研究表明，katG315(G→C)和inhA基因啟動(dòng)子-15位C→T突變型分別占到INH高水平耐藥和低水平耐藥的84%。有學(xué)者認(rèn)為ahpC基因突變極少，可能與耐INH無關(guān)，kasA基因突變與耐INH之間的關(guān)系還需進(jìn)一步研究［9］。本研究中以比例法藥物敏感性試驗(yàn)的耐藥結(jié)果為基礎(chǔ)，基因芯片的RFP耐藥檢出率為90.79%［69/(69+7)］，INH的耐藥檢出率為89.04%［65/(65+8)］，高于崔振玲等［10］報(bào)道的結(jié)果。說明本研究中的基因芯片的設(shè)計(jì)位點(diǎn)包括了主要的耐藥基因易突變位點(diǎn)。對(duì)于哪些基因位點(diǎn)易突變、與耐藥程度的關(guān)系、在本地區(qū)的突變率情況等需要進(jìn)一步研究。當(dāng)然，基因芯片不能檢測出所有的基因突變位點(diǎn)，這在一定程度上也說明基因芯片技術(shù)的不足。

盡管當(dāng)前基因芯片雖不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的藥物敏感性試驗(yàn)方法，且檢出率有待進(jìn)一步提高，但基因芯片分析比傳統(tǒng)方法明顯快速，僅需5～6 h，而且基因芯片的試驗(yàn)條件可控性好，自動(dòng)化程度高，易于標(biāo)準(zhǔn)化。本研究結(jié)果顯示，基因芯片檢測MTB對(duì)RFP和INH的耐藥性較比例法藥物敏感性試驗(yàn)有更高的敏感性和特異性，對(duì)MDR-TB的快速診斷具有重要的臨床價(jià)值。

［1］中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程［M］.北京:中國教育文化出版社，2006:49-51.

［2］Quy HT，Lan NT，Borgdorff MW，et al.Drug resistance among failure and relapse cases of tuberculosis:is the standard retreatment regimen adequate［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2003，7(7):631-636.

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［9］周 江，張萬江.結(jié)核分枝桿菌對(duì)異煙肼和利福平耐藥的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2011，13(1):111-114.

［10］崔振玲，景奉香，胡忠義，等.基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27(7):439-441.