鐘志敏，王 維，莫云丹，戴 卉

(廣州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510180)

原發(fā)性肝癌是指從肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌是世界第5大常見癌癥，也是癌癥導(dǎo)致死亡的第3大常見病因，在我國(guó)的發(fā)病率在消化系統(tǒng)中僅次于胃癌和食管癌，居第3位。肝癌直徑與手術(shù)后的5年生存率密切相關(guān)，腫瘤直徑＜2 cm，5年生存率為100%;腫瘤直徑每增加1 cm，5年生存率下降20%。因此湯釗猷院士把肝癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療稱為二級(jí)預(yù)防，認(rèn)為是患者獲得長(zhǎng)期生存的最主要途徑［1］。甲胎蛋白(AFP)是目前最常用于原發(fā)性肝癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物，但其特異性只有76%～91%，敏感性為39% ～64%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值僅為32%，容易造成大量漏診和誤診［2］。最新研究發(fā)現(xiàn)脫-γ-羧基凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)在原發(fā)性肝癌患者中的陽(yáng)性率較高，被認(rèn)為是另一種特異性較強(qiáng)、敏感性較高的原發(fā)性肝癌血清學(xué)標(biāo)志物［3］。

DCP是一種異常的凝血酶原，最早于1984年由Liebman等［4］發(fā)現(xiàn)。與正常的凝血酶原相比，DCP在其γ-羧基谷氨酸結(jié)構(gòu)中一個(gè)或多個(gè)谷氨酸殘基不能完全羧化為γ-羧基谷氨酸，導(dǎo)致其失去正常凝血功能。在維生素K缺乏或服用維生素K拮抗劑后，凝血酶原的非羧化形式可以釋放入血中。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血漿中DCP會(huì)明顯升高［4］，因此提出 DCP可作為肝癌標(biāo)志物。為了進(jìn)一步確定DCP在原發(fā)性肝癌中的價(jià)值，我們測(cè)定了原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、消化系統(tǒng)腫瘤、慢性肝病、其他肝臟疾病患者血清DCP、AFP濃度，并初步提出了DCP的診斷臨界值。

材料和方法

一、對(duì)象

116例原發(fā)性肝癌患者來(lái)源于2012年1月至2012年4月廣州地區(qū)包括廣州市第一人民醫(yī)院、廣州市腫瘤醫(yī)院、中山醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院等三甲醫(yī)院住院患者，男102例，女14例，年齡30～82歲，病因包括乙型肝炎、丙型肝炎、肝硬化、酒精肝及不明原因，均由病理學(xué)診斷為原發(fā)性肝癌。診斷金標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》(2011年版)確立，病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為肝臟占位病灶或者肝外轉(zhuǎn)移灶活檢或手術(shù)切除組織標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)檢查診斷為肝細(xì)胞癌。原發(fā)性肝癌按TNM分期以Ⅲ、Ⅳ期為主。另外收集臨床診斷為慢性肝病(肝炎、肝硬化)50例、繼發(fā)性肝癌57例、其他肝病(包括酒精性肝病、藥物或毒物性肝病、新陳代謝異常性肝病以及由酗酒、糖尿病、血脂肪過高、體重過重等引起的脂肪性肝病)患者73例、消化系統(tǒng)腫瘤(包括大腸癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等)52例。選擇同期在廣州市第一人民醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康人50名作為正常對(duì)照組，男24名，女26名，年齡23～84歲。入選標(biāo)準(zhǔn):血、尿、便三大常規(guī)正常，血生化肝功能正常，肝、膽、胰B超正常。

二、儀器和試劑

LUMIPULSE G1200型全自動(dòng)免疫分析儀(日本富士瑞必歐株式會(huì)社)。DCP試劑盒LUMIPULSE PIVAK-Ⅱ Eisai(批號(hào) GDX2064)、異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)校準(zhǔn)液(批號(hào)GXX2065);AFP原裝配套試劑盒(批號(hào)JDX2063)，AFP校準(zhǔn)液(批號(hào)JXX2073)。

二、方法

所有對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血，常規(guī)分離血清。DCP、AFP采用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA)檢測(cè)。DCP陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說(shuō)明書，以DCP≥27.8 mAu/mL為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。DCP結(jié)果呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)(范圍)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。繪制DCP的受試者工作特征(ROC)曲線，計(jì)算敏感性、特異性及診斷原發(fā)性肝癌的最佳診斷值。各類數(shù)據(jù)間用直線相關(guān)分析及pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組DCP濃度及陽(yáng)性率比較

原發(fā)性肝癌組DCP濃度明顯高于繼發(fā)性肝癌組、消化系統(tǒng)腫瘤組、慢性肝病組、其他肝臟疾病組和正常對(duì)照組(P＜0.05)，而正常對(duì)照組、慢性肝病組、消化系統(tǒng)腫瘤組、其他肝臟疾病組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組DCP濃度及陽(yáng)性率比較

二、ROC曲線分析

分別以正常對(duì)照組和其他5組(正常對(duì)照組、慢性肝病組、消化系統(tǒng)腫瘤、其他肝臟疾病、繼發(fā)性肝癌)為對(duì)照，繪制ROC曲線，其曲線下面積分別為0.817和0.814。根據(jù)約登指數(shù)最大為最佳臨界值，計(jì)算得DCP診斷原發(fā)性肝癌的臨界值分別為42.0和44.5 mAU/mL。當(dāng)DCP臨界值為42.0 mAU/mL時(shí)靈敏度為74.2%、特異性為100%;當(dāng)DCP臨界值為44.5 mAU/mL時(shí)，靈敏度為74.2%、特異性為88.6%。臨界值應(yīng)將原發(fā)性肝癌與其他肝臟疾病分開，而非相對(duì)區(qū)分正常對(duì)照組，故采用44.5 mAU/mL作為診斷原發(fā)性肝癌的最佳臨界值。

圖1 DCP診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

三、DCP、AFP單項(xiàng)診斷和聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌的價(jià)值

1.DCP檢測(cè)結(jié)果有45例與診斷金標(biāo)準(zhǔn)不符，其中有22例經(jīng)診斷金標(biāo)準(zhǔn)確診為陽(yáng)性，而DCP檢測(cè)結(jié)果呈陰性;23例經(jīng)診斷金標(biāo)準(zhǔn)診斷為陰性，而DCP檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。DCP的靈敏度為81.03%、特異性為91.25%，Kappa值為0.721。見表2。

表2 單項(xiàng)診斷時(shí)DCP檢測(cè)結(jié)果與診斷金標(biāo)準(zhǔn)的比較

2.AFP檢測(cè)結(jié)果有36例與診斷金標(biāo)準(zhǔn)不符，其中有13例經(jīng)診斷金標(biāo)準(zhǔn)確診為陽(yáng)性，而AFP檢測(cè)結(jié)果呈陰性;23例經(jīng)診斷金標(biāo)準(zhǔn)診斷為陰性，而AFP檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。AFP的靈敏度為88.79%、特異性為91.25%，Kappa值為0.782。見表3。

3.以DCP和AFP檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性確定為陽(yáng)性。DCP和AFP聯(lián)合診斷時(shí)的特異性可高達(dá)96.20%，靈敏度也可提高至91%。相比于單項(xiàng)診斷，聯(lián)合診斷提高了診斷效能。見表4。

表3 單項(xiàng)診斷時(shí)AFP檢測(cè)結(jié)果與診斷金標(biāo)準(zhǔn)的比較

表4 聯(lián)合診斷時(shí)檢測(cè)結(jié)果與診斷金標(biāo)準(zhǔn)的比較

五、DCP和AFP的相關(guān)性分析

分別對(duì)所有研究對(duì)象(379例)和原發(fā)性肝癌患者(116例)做DCP和AFP的相關(guān)性分析。在所有研究對(duì)象中，DCP與AFP的Pearson相關(guān)系數(shù)(r)=0.077，P=0.133，兩者無(wú)相關(guān)性。在原發(fā)性肝癌患者中，DCP與 AFP的 r=0.026，P=0.782，兩者無(wú)相關(guān)性。

討 論

原發(fā)性肝癌是世界常見癌癥，也是癌癥導(dǎo)致死亡的常見病因。雖然原發(fā)性肝癌的治愈率很低，但在原發(fā)性肝癌早期仍然有望治愈。血清AFP是一種糖蛋白，是全世界最常用的肝細(xì)胞癌監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物。已被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌，但其在早期診斷中的價(jià)值仍非常有限。然而，對(duì)于監(jiān)測(cè)試驗(yàn)而言，單獨(dú)采用AFP并不充分，尤其在HCV相關(guān)的肝癌中［5］。

由維生素K缺乏或?qū)贵w-Ⅱ誘導(dǎo)產(chǎn)生的凝血酶原是一種缺乏凝結(jié)活性的異常凝血酶原，也稱為DCP。Liebman等［4］在1984年首次描述了肝細(xì)胞癌患者血清DCP的升高具有高度的相關(guān)性和特異性。DCP與正常凝血酶原均是肝細(xì)胞合成的，其與正常凝血酶原的差異僅在于氨基端特定位置上的谷氨酸殘基未經(jīng)羧化，即去羧基凝血酶原。由于γ-谷氨酸殘基的羧基是與鈣結(jié)合的一個(gè)功能區(qū)，如果缺乏就失去與鈣結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，故DCP無(wú)凝血酶原的功能。DCP存在于大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者的血清中，服用維生素并不消失。研究證實(shí)［6］在維生素K缺乏或服用維生素K拮抗劑后，凝血酶原的非羧化形式可以釋放入血中，導(dǎo)致DCP增多。有關(guān)DCP診斷原發(fā)性肝癌的早期報(bào)道大多用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定，原發(fā)性肝癌例數(shù)少、缺乏病理學(xué)診斷［7］。受方法學(xué)限制，DCP測(cè)定的靈敏性、特異性都不太理想。近年來(lái)，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定DCP，靈敏性、特異性得到大大提高。在美國(guó)、日本報(bào)道較多，我國(guó)正在引進(jìn)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定DCP。

本研究采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定原發(fā)性肝癌患者的DCP濃度。原發(fā)性肝癌患者中DCP陽(yáng)性率高達(dá)77%，中位數(shù)為1 148.5 mAU/mL，繼發(fā)性肝癌、消化系統(tǒng)腫瘤、慢性肝病、其他肝臟疾病、健康體檢者陽(yáng)性率分別為 46%、19%、18%、25%、16%。原發(fā)性肝癌組DCP濃度和陽(yáng)性率均明顯高于其他各組(P＜0.05)，與楊玉芳等［8］報(bào)道的結(jié)果基本一致。DCP在其他疾病存在陽(yáng)性的原因尚不明了，在進(jìn)行單項(xiàng)診斷時(shí)的診斷學(xué)評(píng)價(jià)中，DCP的靈敏度為81.03%、特異性為91.25%、Kappa值為0.721，靈敏度和特異性均較高，與診斷金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果相比具有較好的一致性。

本研究結(jié)果顯示DCP診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線下面積為0.814，以44.5 mAU/mL為最佳臨界值時(shí)的靈敏度為74.2%、特異性為88.6%，高于 CUI等［9］的研究結(jié)果(特異性為86.7%、靈敏度為51.7%)，與 Gomaa 等［10］的研究結(jié)果(靈敏度為48% ～62%、特異性為81% ～98%)基本一致。當(dāng)患者DCP＞44.5 mAU/mL時(shí)高度懷疑為原發(fā)性肝癌，但不排除繼發(fā)性肝癌(部分患者DCP也升高，但原因不明)和維生素K缺乏的患者。本研究中有一小部分原發(fā)性肝癌患者的DCP仍較低，具體原因不明，與其他腫瘤標(biāo)志聯(lián)合檢測(cè)可降低其漏檢率和誤診率，特別是與AFP。肝炎、肝硬化患者的血清AFP濃度也會(huì)升高，容易導(dǎo)致假陽(yáng)性［11］。本研究50例慢性肝病(肝炎、肝硬化)患者中只有9例DCP陽(yáng)性，平均為(21.9±9.0)mAU/mL，且全部 ＜42.0 mAU/mL，基本可以排除慢性肝病干擾。由此可見，DCP是輔助診斷肝癌的一個(gè)良好的生物學(xué)標(biāo)志物。

據(jù)報(bào)道，DCP和AFP之間沒有相互關(guān)聯(lián)，但可在發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌時(shí)互相補(bǔ)充［12］。本研究對(duì)所有研究對(duì)象和原發(fā)性肝癌患者分別做了2種檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析，DCP與AFP的Pearson相關(guān)系數(shù)為0.026(P=0.782)，DCP與AFP無(wú)相關(guān)性。Beale等［13］的研究也表明肝細(xì)胞癌患者是通過不同的途徑產(chǎn)生DCP和AFP。有學(xué)者［14］認(rèn)為雖然DCP對(duì)于肝細(xì)胞癌早期發(fā)現(xiàn)而言靈敏度低，但其特異性高，可以通過將DCP與AFP相結(jié)合的方式提高靈敏度。因此，對(duì)于慢性HBV感染患者的肝細(xì)胞癌早期發(fā)現(xiàn)，DCP能夠作為一個(gè)有效的腫瘤標(biāo)志物，尤其是與 AFP相結(jié)合的情況下。Lok等［15］研究了具有相同肝病病因的患者，病例和對(duì)照完全匹配，開展了至少為期12個(gè)月的隨訪，結(jié)果顯示單用DCP或AFP并不能得到最佳的肝細(xì)胞癌檢測(cè)效果，但是兩者合用可提高靈敏度，說(shuō)明這2種標(biāo)志物是相輔相成的。而該研究的獨(dú)特之處在于在肝細(xì)胞癌診斷前12個(gè)月內(nèi)就采集了標(biāo)本，從而有利于評(píng)估DCP和AFP在區(qū)分臨床前肝細(xì)胞癌病例和對(duì)照組時(shí)的性能。本研究也顯示DCP和AFP聯(lián)合診斷時(shí)的特異性可高達(dá)96%以上，靈敏度也可提高至91%以上。相比于單項(xiàng)診斷，聯(lián)合診斷提高了診斷效能。

綜上所述，DCP診斷原發(fā)性肝癌的靈敏性與特異性各個(gè)報(bào)道略有不同。本研究結(jié)果顯示DCP檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和特異性均較高，并且與診斷金標(biāo)準(zhǔn)相比具有較好的一致性。但本研究偏粗淺，原發(fā)性肝癌分組不夠細(xì)，病例數(shù)也不夠多。DCP對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷作用有待更多的數(shù)據(jù)支持，但可以確定的結(jié)論是兩者合用可提高原發(fā)性肝癌診斷的靈敏度與特異性，進(jìn)而提高了診斷效能。

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