周運(yùn)恒，馬紅霞，曹廣亞，石曉星，劉風(fēng)華

(1.警上海市總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201103;2.上海市東方醫(yī)院體驗(yàn)中心，上海200120)

解脲脲原體(ureaplasma urealyticum，Uu)是泌尿生殖道感染較為常見的病原微生物之一，在特定的條件下可以致病，可引起非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)、宮頸炎、前列腺炎、不孕不育癥等，其致病性與宿主免疫力、Uu的血清型或基因型等因素有關(guān)。目前Uu檢測(cè)主要是采用液體培養(yǎng)法，已經(jīng)沿用近20年，但在臨床中已暴露出很多缺陷，如假陽性率高［1］、假陰性以及污染干擾嚴(yán)重［1］等。固體瓊脂法可以觀察支原體特征性的菌落，如“海膽型”或“油煎蛋樣”菌落是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于操作煩鎖、培養(yǎng)時(shí)間長以及試劑有效期短等原因，目前國內(nèi)外臨床上僅有少數(shù)醫(yī)院在應(yīng)用，且支原體形態(tài)和菌落較難辨認(rèn)，所以對(duì)Uu形態(tài)學(xué)的研究較少。本研究采用選擇性固體培養(yǎng)基-液體培養(yǎng)基一步法比較2種培養(yǎng)方法檢測(cè)Uu結(jié)果的差異，并觀察男女不同類型標(biāo)本中Uu菌落形態(tài)學(xué)的差異。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象 2011年3至9月武警上海市總隊(duì)醫(yī)院門診婦科、皮膚科、不育不孕科及泌尿外科就診患者共1 698例。其中，女性宮頸分泌物標(biāo)本1 030例，男性尿道分泌物標(biāo)本156例，精液標(biāo)本512例。

2.試劑 支原體液體培養(yǎng)基由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供，Uu選擇分離培養(yǎng)基由河北微拉生物科技有限公司提供，用OLYMPUS CR21顯微鏡觀察并拍照。標(biāo)準(zhǔn)菌株為Uu(ATCC 27813)，由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供。

二、方法

1.標(biāo)本采集 男性患者的尿道拭子:消毒尿道口后自行由內(nèi)向外擠壓陰莖數(shù)次，用無菌小棉拭子蘸取無菌生理鹽水少許輕輕插入尿道口1～2.5 cm處，360°輕轉(zhuǎn)3～5圈蘸取分泌物，將取樣后的棉拭子插入專用無菌試管中。精液:按照常規(guī)方法取出，禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯內(nèi)(收集標(biāo)本前排尿，并用無菌水清洗尿道口)，置37°C水浴箱內(nèi)液化。女性患者:采樣前3 d內(nèi)未使用陰道內(nèi)藥物或沖洗陰道，24 h內(nèi)無性行為，避開月經(jīng)期采集;采集時(shí)常規(guī)消毒外陰，用陰道窺器擴(kuò)張后，先用無菌棉球清除宮頸口分泌物，另取小棉拭子蘸取無菌生理鹽水少許插入患者宮頸口1～2 cm處單層柱狀上皮細(xì)胞，360°輕轉(zhuǎn)3～5圈，停留片刻取出，放入配套的無菌容器中，立即送檢。

2.直接接種法 將取材后的拭子或液化后的精液在固體選擇分離培養(yǎng)基表面涂抹接種，并放入CO2發(fā)生片;然后接種分泌物標(biāo)本或液化后的精液于支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，在37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。所有操作步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

3.結(jié)果判斷 液體培養(yǎng)基判斷標(biāo)準(zhǔn):培養(yǎng)48 h，液體培養(yǎng)基由黃色變成紅色和橙紅色，凡≥104CFU/mL鑒定孔試劑變色為Uu陽性的篩選對(duì)象，＜104CFU/mL為攜帶者或無致病意義。固體培養(yǎng)基陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):培養(yǎng)48 h，用顯微鏡在低倍鏡下觀察固體培養(yǎng)基支原體的菌落生長情況，以看到固體培養(yǎng)基上生長的支原體菌落(如“海膽型”或“油煎蛋樣”等)作為陽性的確診標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)可疑時(shí)可以延長培養(yǎng)至72～168 h再觀察。一般情況下，Uu菌落較小，圓形，棕褐色;人型支原體菌落較大，無色，有寬大透明周邊帶環(huán)繞的油煎蛋樣。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用 SPSS 15.0軟件進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、支原體感染陽性率

液體培養(yǎng)法與固體培養(yǎng)法相比，女性宮頸分泌物標(biāo)本Uu陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而男性精液和尿道分泌物標(biāo)本Uu陽性率之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。以固體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)判斷，發(fā)現(xiàn)女性生殖道分泌物標(biāo)本的Uu陽性率最高(49.9%)，明顯高于男性精液和尿道分泌物標(biāo)本(P均＜0.05)。見表1。

表1 2種方法培養(yǎng)不同類型標(biāo)本支原體陽性率結(jié)果

二、固體培養(yǎng)基上不同類型標(biāo)本支原體形態(tài)學(xué)觀察

Uu菌落存在多形性，主要的菌落形態(tài)有:海膽型(形似海膽，棕黑色，圓形或不規(guī)則形，大小不等，內(nèi)部有布紋樣結(jié)構(gòu)，單個(gè)或多個(gè)菌落聚集在一起)、油煎蛋型(形似油煎蛋，棕黃色，圓形，核心顆粒致密)、空泡型(邊緣顆粒致密呈棕黑色，內(nèi)部無色疏松)、微小型(菌落較小，棕黑色)、棒狀(棕黑色，長短、粗細(xì)不等)，而且同一種菌落在不同類型標(biāo)本中其菌落大小和數(shù)量等方面也不完全一致。見圖1、圖2。

三、不同類型標(biāo)本Uu菌落形態(tài)分布

在3種不同類型標(biāo)本中，Uu菌落形態(tài)均以海膽型菌落為主(77.5%)，其次是油煎蛋樣(13.8%)，而微小型、空泡型和棒狀較少見，另外存在2種以上形態(tài)的混合型菌落。見表2。

圖1 女性宮頸分泌物中Uu形態(tài)(×100)

圖2 精液標(biāo)本中Uu形態(tài)(×100)

表2 不同類型標(biāo)本Uu菌落形態(tài)分布

討 論

傳統(tǒng)的支原體分離培養(yǎng)過程應(yīng)有2個(gè)部分，肉湯增菌和濾液轉(zhuǎn)種，觀察其菌落形態(tài)，然后進(jìn)行Diense染色和生化反應(yīng)最終報(bào)告。但間接轉(zhuǎn)種法由于轉(zhuǎn)種的時(shí)間選擇不當(dāng)也存在一定的假陰性。由于固體培養(yǎng)法操作和觀察結(jié)果繁瑣，在上海地區(qū)幾乎沒有醫(yī)院采用固體培養(yǎng)法，而且有的液體培養(yǎng)法不做定量計(jì)數(shù)和藥物敏感性試驗(yàn)。據(jù)吳磊等［2］報(bào)道在2008年上海市共有124家臨床實(shí)驗(yàn)室參與Uu室間質(zhì)控，結(jié)果顯示Uu陽性標(biāo)本、干擾菌和陰性模擬物3種標(biāo)本均符合的只有39家，可見試劑質(zhì)量參差不齊。本研究采用的是一步培養(yǎng)法，與傳統(tǒng)的二步法相比可以節(jié)約時(shí)間，減少工作量，而且操作方便，利用劃痕能容易在瓊脂層表面找到支原體菌落［3］。一些小樣本研究發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法相比在陽性率結(jié)果方面存在爭(zhēng)議，而且多以女性的標(biāo)本為主，沒有按照標(biāo)本類型分別研究［4-5］。我們通過1 698例大樣本研究發(fā)現(xiàn)在檢測(cè)女性Uu陽性率時(shí)，液體培養(yǎng)法的陽性率要高于固體培養(yǎng)法，而對(duì)于男性標(biāo)本，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能是由于男、女性泌尿生殖道Uu寄存環(huán)境的差異，一步法與兩步法假陰性的差異以及試劑廠商不同、抑制細(xì)菌的能力和檢測(cè)率差異所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，液體培養(yǎng)法存在較高的假陽性，尤其是女性宮頸分泌物標(biāo)本，男性精液和尿道分泌物標(biāo)本液體培養(yǎng)法雖然也存在一定的假陽性，但與固體培養(yǎng)法相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主要原因可能是男女生殖道寄居或感染分解尿素的細(xì)菌不同所致［6］。另外標(biāo)本中某些酵母菌和葡萄球菌的污染以及堿性標(biāo)本也是液體培養(yǎng)法假陽性增加的原因。據(jù)曹愛國等［7］研究報(bào)道，液體培養(yǎng)基的假陽性率在20%左右。我們發(fā)現(xiàn)有6.3%(65/1 030)的女性患者Uu液體培養(yǎng)法結(jié)果僅陽性對(duì)照孔變色或半定量結(jié)果≤104CFU/mL，但在固體培養(yǎng)基上可以觀察到典型的支原體菌落。這種假陰性可能是:標(biāo)本分泌物量少或接種量少、標(biāo)本未及時(shí)接種而引起支原體死亡以及不分解尿素的支原體存在所致。

本研究女性宮頸分泌物標(biāo)本中Uu感染率(49.9%)明顯高于男性精液(39.6%)，與夏晴晴等［8］報(bào)道的女性生殖泌尿道支原體的感染率基本一致。這可能與男性寄居或感染的菌株型別不同，女性的生理解剖學(xué)特殊而更易感染Uu，或者是與女性到醫(yī)院的就診率較高有關(guān)。男性精液感染率較高，可能與患者多來自不孕不育科有關(guān)，而不育不孕癥患者Uu陽性率要顯著高于一般人群［9-10］。而男性尿道分泌物中 Uu感染率最低(19.2%)，明顯低于文獻(xiàn)中報(bào)道的感染率，可能與患者類型、分泌物標(biāo)本量少直接影響結(jié)果有關(guān)。由于尿道感染支原體容易治愈，而前列腺和附睪感染的支原體不容易治愈，因此李志軍等［11］建議男性泌尿生殖道感染的首診和復(fù)查患者宜采用精液檢測(cè)支原體，不容易漏診。

文獻(xiàn)和教科書中一般認(rèn)為Uu的菌落形態(tài)是海膽型或油煎蛋樣。本研究中Uu主要是以典型的海膽型菌落為主，也存在油煎蛋樣、空泡型、微小型、棒狀和混合型等其他不同形態(tài)。這種異質(zhì)性的主要原因是由于不同菌株生長特性和生化反應(yīng)的差異導(dǎo)致菌落數(shù)量和形態(tài)學(xué)的差異。Uu根據(jù)分子生物學(xué)特征被分成14個(gè)血清型或2個(gè)生物群［12］。另外不同標(biāo)本中因支原體含量的差異，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件如氣壓、濕度的不同而呈多形性［13］。潘展硯等［14］觀察了99例 Uu菌落，發(fā)現(xiàn)主要菌落形態(tài)為海膽型，形態(tài)的異質(zhì)性與細(xì)菌性陰道炎致病性有關(guān)。我們?cè)谂R床上發(fā)現(xiàn)男女Uu菌落形態(tài)學(xué)存在一定的差異，可能主要是由于Uu寄生的環(huán)境生物學(xué)特性差異以及寄居在男女生殖泌尿道的Uu的型別不同所致［15-17］。

因此，固定培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基聯(lián)合檢測(cè)，觀察培養(yǎng)基顏色變化和菌落特征，可以提高Uu檢測(cè)的特異性和敏感性，降低假陽性率和假陰性率，更好地為臨床診治提供客觀的依據(jù)。但是2種培養(yǎng)方法的共同缺點(diǎn)是耗時(shí)長，不利于疾病的快速診斷和治療，而且不能對(duì)支原體進(jìn)行分型，尤其是固體培養(yǎng)法操作較煩鎖，今后可將標(biāo)本類型、菌落形態(tài)學(xué)與基因分型結(jié)合起來，通過大批量樣本來系統(tǒng)研究不同類型的Uu與致病性或耐藥性的關(guān)系，對(duì)于Uu感染的流行病學(xué)調(diào)查、診斷與防治將具有更重要的意義。

［1］張紅升，韓 晶.支原體液體培養(yǎng)法假陽性原因探討［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(4):316-318.

［2］吳 磊，楊 陽，顧偉鳴.上海市醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)解脲脲原體質(zhì)量分析［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2009，23(1):34-35.

［3］孟冬婭，薛文成，馬曉博，等.兩種接種固體培養(yǎng)基方法檢測(cè)泌尿生殖道分泌物中支原體［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，22(3):74-75.

［4］邢建明，李 剛，張雅琴，等.兩種不同培養(yǎng)方法檢測(cè)解脲、人型支原體結(jié)果平行性分析［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20(6):1442-1443.

［5］劉長德，張 艷，于成源，等.支原體培養(yǎng)假陽性結(jié)果原因分析［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29(3):214.

［6］徐 晨，宋文剛.生殖系微生物與免疫學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:15-16.

［7］曹愛國，蔡永君.濟(jì)寧地區(qū)女性泌尿生殖道解脲脲原體基因分型與耐藥初探［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(3):69-71.

［8］夏晴晴，王 芳，賀 娟.男女泌尿生殖道支原體屬感染特點(diǎn)的分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20(8):1188-1190.

［9］王厚照，張 玲，尚碧蓮，等.生殖道支原體感染與男性不育關(guān)系的探討及藥敏結(jié)果的分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，30(5):121-122.

［10］Gdoura R，Kchaou W，Chaari C，et al.Ureaplasma urealyticum，Ureaplasma parvum，Mycoplasma hominis and Mycoplasma genitalium infections and semen quality of infertile men［J］.BMC Infect Dis，2007，7:129.

［11］李志軍，王 勇，袁紅瑛，等.男性泌尿生殖道感染支原體培養(yǎng)樣本選擇［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(6):888-890.

［12］Pitcher D，Sillis M，Robertson JA.Simple method for determining biovar and serovar types of Ureaplasma urealyticum clinical isolates using PCR-single-strand conformation polymorphism analysis［J］.J Clin Microbiol，2001，39(5):1840-1844.

［13］ 曹玉璞，葉元康.支原體與支原體?。跰］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:74

［14］潘展硯，黃崢燁，賈亞利，等.解脲脲原體菌落形態(tài)異質(zhì)性的初步研究［J］.生殖與避孕，2007，27(2):120-123.

［15］徐 晨，周作民.生殖生物學(xué)理論與實(shí)踐［M］.上海:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2005:236.

［16］Yoshida T，Deguchi T，Meda S，et al.Quantitative detection of Ureaplasma parvum(biovar 1)and Ureaplasma urealyticum (biovar2)in urine specimens from men with and without urethritis by real-time polymerase chain reaction［J］.Sex Transm Dis，2007，34(6):416-419.

［17］Couldwell DL，Gidding HF，F(xiàn)reedman EV，et al.Ureaplasma urealyticum is significantly associated with non-gonococcal urethritis in heterosexual Sydney men［J］.Int J STD AIDS，2010，21(5):337-341.