宋 穎，王 青，許 蕾，胡曉波

(1.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海200126;2.上海市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海201999)

近年來，醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室中全自動血液分析儀日益普及，隨之而來的復(fù)檢問題則越發(fā)顯得突出，特別是對于儀器提示報警信號需要人工復(fù)片的檢測樣本，由于需要有經(jīng)驗(yàn)、訓(xùn)練有素的檢驗(yàn)技師用肉眼顯微鏡觀察的方式完成細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，處理速度較慢。血涂片鏡檢的勞動強(qiáng)度制約了分類計數(shù)結(jié)果的可靠性。

為了解決這個矛盾，近年來開發(fā)出一種全自動的顯微鏡分析系統(tǒng)Cellavision。這種系統(tǒng)將顯微鏡與計算機(jī)智能模塊相整合，能夠自動對外周血涂片進(jìn)行分析，對白細(xì)胞和紅細(xì)胞進(jìn)行預(yù)分類［1］。并且能對血涂片進(jìn)行數(shù)字化處理，得到單個白細(xì)胞形態(tài)圖片、紅細(xì)胞形態(tài)圖片和全片血涂片掃描圖。與此同時，英國的UK NEQAS已經(jīng)率先在2005年開發(fā)出一種網(wǎng)絡(luò)化的數(shù)字形態(tài)學(xué)計劃，使其用于室間調(diào)查計劃和繼續(xù)教育計劃。通過網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行數(shù)字化的閱片，分析圖片上細(xì)胞的形態(tài)學(xué)信息，并且回報分析結(jié)果，再將結(jié)果及時反饋參加成員［2］。

為了驗(yàn)證這一系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和有效性，上海市臨床檢驗(yàn)中心血液體液室(以下簡稱“我室”)采用了Cellavision分析系統(tǒng)中的外周血涂片數(shù)字化模塊，建立了細(xì)胞庫。于2011年10月至11月間對93家上海市二級甲等以上醫(yī)院和少量社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心進(jìn)行了一次電子圖譜顯微鏡細(xì)胞形態(tài)現(xiàn)場調(diào)查，調(diào)查的內(nèi)容包括兩個方面:外周血白細(xì)胞分類計數(shù)和血涂片形態(tài)描述，并且對此次調(diào)查的方式和數(shù)字化圖片的質(zhì)量進(jìn)行滿意度評估。

材料和方法

一.材料

1.在上海市臨床檢驗(yàn)中心自建的細(xì)胞庫中選取15張外周血涂片，這些涂片由世界衛(wèi)生組織(WHO)提供。

2.病例的選擇與細(xì)胞庫 自建的細(xì)胞圖片庫尚在起步階段，錄入的病例數(shù)約為100例左右。所收錄的病例有嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)滿足以下條件:(1)信息完整;(2)診斷明確;(3)涂片制片、染色質(zhì)量高;(4)拍攝圖片清晰?；谝陨弦?，目前所收錄的病例大多來源于WHO。WHO提供高質(zhì)量的血涂片，我們將此涂片在Cellavision全自動圖片掃描儀上掃描，獲取清晰的單個細(xì)胞圖片。WHO同時也提供了此涂片明確的實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果和臨床診斷，包括:(1)血液分析儀全血細(xì)胞計數(shù)和分類計數(shù)結(jié)果，患者基本信息，入院就診情況。簡要的病史資料，常規(guī)生化檢查，特定項(xiàng)目生化檢查，血紅蛋白電泳，MICM(外周血涂片分類及參考范圍，骨髓形態(tài)分析，CD分型檢測，染色體檢查)等一系列與診斷密切相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果;(2)權(quán)威專家分析結(jié)果，包括病例診斷說明及形態(tài)學(xué)鑒別診斷;(3)WHO采用May-Grunwald Giemsa染色。細(xì)胞圖片和染色清晰;(4)采用先進(jìn)的Cellavision圖片掃描技術(shù)，得到單個細(xì)胞的清晰圖像。圖片的類型與病例數(shù)，見表1。

表1 WHO血涂片所屬類型

3.采用雙盲法編組，對醫(yī)院的形態(tài)學(xué)識別能力做現(xiàn)場調(diào)查并統(tǒng)計。

二.方法

1.圖片的選擇 這次調(diào)查對病種的選擇上加以限制:選擇白細(xì)胞分類相對正常，分類難度較低的疾病類型。為了避免調(diào)查醫(yī)院間的重復(fù)，選擇15例病例，分配至93家醫(yī)院，每家醫(yī)院觀察一例病例，即本次調(diào)查分為15組。每例病例所對應(yīng)的醫(yī)院數(shù)約為5～7家，而且在涂片觀察的難易程度上基本保持一致。

2.外周血涂片掃描 將外周血涂片放在Cellavision分析系統(tǒng)進(jìn)行規(guī)范化處理，處理后的數(shù)據(jù)錄入細(xì)胞庫中，每個選取病例的白細(xì)胞數(shù)為(300～400)個。

3.數(shù)字化圖片 將掃描的白細(xì)胞涂片及其他類型的細(xì)胞涂片導(dǎo)入大容量存儲設(shè)備。分配至每家醫(yī)院的資料中包含患者的基本資料包括:性別，年齡，發(fā)病情況和白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計數(shù)結(jié)果和血紅蛋白測定結(jié)果，觀察圖片的說明，以及(400～1 000)張數(shù)字化的細(xì)胞掃描圖(白細(xì)胞和其他類型細(xì)胞)。

4.結(jié)果報告方式 按照說明中的所示要求回報結(jié)果。先作白細(xì)胞分類計數(shù)，再將觀察到的細(xì)胞圖片情況進(jìn)行描述，要求在1 h內(nèi)完成報告。并在閱片完成后對此次調(diào)查的形式和圖片質(zhì)量做出評估。

結(jié) 果

一、滿意度評價

共發(fā)放93份問卷，返回81份。滿意度評價結(jié)果見表2。

表2 滿意度評價表

大部分醫(yī)院接受此種電子圖譜顯微鏡細(xì)胞形態(tài)學(xué)調(diào)查方式，認(rèn)為清晰度高、細(xì)胞形態(tài)完整、沒有生物學(xué)污染;而且在公正性和結(jié)果一致性方面也優(yōu)于血涂片觀察。缺點(diǎn)在于，有些醫(yī)院的檢驗(yàn)員習(xí)慣采用顯微鏡肉眼觀察的方式，對直接看數(shù)字化圖片不適應(yīng)。對于圖譜的質(zhì)量大部分醫(yī)院也表示滿意，但最好能提供低倍，視野更大的圖譜，便于總體觀察。認(rèn)為在保證數(shù)字化圖片質(zhì)量的前提下，此種方法更方便，清晰，易于計數(shù)。

二、病例類型

由于限制白細(xì)胞分類的閱片難度，所選擇的病例紅細(xì)胞系統(tǒng)異常占多數(shù)，所以閱片的難點(diǎn)在于對紅細(xì)胞形態(tài)的識別和描述。

三、白細(xì)胞分類的評價

雖然每張血涂片WHO都給出了明確的診斷和細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果，但我室在參考此結(jié)果的同時，也對回報的分類結(jié)果用 Rümke法進(jìn)行統(tǒng)計［3］，得出均值和允許范圍。由于白細(xì)胞分類計數(shù)所得結(jié)果為百分比，所以僅以白細(xì)胞中的粒細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(p)和非粒細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(1-p)作為依據(jù)計算Rümke范圍［3］。且粒細(xì)胞計數(shù)結(jié)果在細(xì)胞計數(shù)數(shù)量較大的情況下可視為符合正態(tài)分布［4］，所以可計算組內(nèi)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV%)，見表3。

表3 白細(xì)胞分類計數(shù)結(jié)果的評價

表3結(jié)果顯示，依據(jù)調(diào)查結(jié)果得出的Rümke范圍與WHO范圍存在差異，而二者間的平均值、SD和CV%，做配對t檢驗(yàn)得到結(jié)果分別為P=0.438 8，P=0.150 4，P=0.181 5，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

四、形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

本次調(diào)查除了要求對白細(xì)胞進(jìn)行分類之外，還要求對圖譜上所示的異常形態(tài)進(jìn)行描述。形態(tài)學(xué)特點(diǎn)則參考WHO提供的5個最明顯的形態(tài)特征，調(diào)查所占百分比最高的為紅細(xì)胞系統(tǒng)疾病，所以形態(tài)學(xué)特點(diǎn)以紅細(xì)胞系統(tǒng)形態(tài)異常居多(19項(xiàng))，白細(xì)胞系統(tǒng)次之(10項(xiàng))，血小板最少(5項(xiàng))，各系統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征的符合率見表4。

表4 各系統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征的符合率

討 論

一、對于此種全新的電子圖譜顯微鏡調(diào)查形式，大多數(shù)醫(yī)院表示滿意，并且愿意接受。

二、數(shù)字化圖片與血涂片顯微鏡鏡檢白細(xì)胞分類結(jié)果比較后，可得出以下幾點(diǎn):

1.觀察區(qū)域的差異 采用數(shù)字化掃描后，觀察區(qū)域存在限制性。常規(guī)顯微鏡觀察則很難做到不同觀察者所觀察的區(qū)域一致。

2.細(xì)胞數(shù)量的差異 本次調(diào)查掃描的白細(xì)胞數(shù)大致為300～400個，每家醫(yī)院自行確定所觀察的細(xì)胞數(shù)量。但即使全部觀察，也只觀察了400個左右的白細(xì)胞。而血涂片顯微鏡觀察由于區(qū)域的不確定，所以不同觀察者所看的細(xì)胞總和幾乎都＞400個。

3.細(xì)胞觀察重合度的差異 掃描次序?yàn)橹鹨粧呙?，所以?yán)格按照生成的圖片先后的序列排列，即圖片的序列號排列，調(diào)查時觀察者一般均按照此序列觀察，不同觀察者所看的圖片重合度極高，而常規(guī)血涂片顯微鏡觀察往往區(qū)域分散，很難做到所看細(xì)胞的一致。

4.細(xì)胞平均數(shù)的一致 實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的調(diào)查平均值與WHO平均值無明顯差異，證實(shí)了細(xì)胞分類結(jié)果的可靠性。

鑒于以上幾點(diǎn)原因，直接導(dǎo)致本次調(diào)查所得到的Rümke范圍與WHO給出的范圍不一致，所以應(yīng)對數(shù)字化的圖片分類結(jié)果進(jìn)行修正。兩者間的平均值、SD和CV%無明顯性差異，則說明在掃描圖片質(zhì)量得到保證的前提下，可以替代血涂片進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

三、重新回顧細(xì)胞圖片后發(fā)現(xiàn)存在以下幾個問題

1.對于特殊細(xì)胞形態(tài)不認(rèn)識，如:G6PD酶缺乏時出現(xiàn)的咬細(xì)胞(bite cell)、鐮刀狀紅細(xì)胞和球形紅細(xì)胞。

2.對于某些細(xì)胞的特征性改變的數(shù)量達(dá)到多少比例報告沒有概念。

3.細(xì)胞圖片中某一類細(xì)胞數(shù)量明顯增多(如圖片中棘形紅細(xì)胞明顯增多占紅細(xì)胞總數(shù)的50%)，其他細(xì)胞特征(如:靶形紅細(xì)胞、紅細(xì)胞碎片)相對不明顯。

4.紅細(xì)胞呈緡錢狀排列，干擾單個紅細(xì)胞形態(tài)識別，無法辨識紅細(xì)胞大、小不一。

5.對于嗜堿性點(diǎn)彩紅細(xì)胞等紅細(xì)胞胞內(nèi)含有的細(xì)小顆粒識別度不夠。

6.僅在某幾張圖片中出現(xiàn)的形態(tài)學(xué)特征，可能會遺漏(如:血小板成堆現(xiàn)象僅出現(xiàn)在一兩張圖片中，相對于400張左右的圖片，所占比例過低)。

四、改進(jìn)措施

1.為了提高圖片中所含紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)信息，應(yīng)同時提供倍數(shù)相對較低，但視野較廣的圖片。Cellavision的紅細(xì)胞模塊，可以將多個視野所觀察到的圖片經(jīng)過計算機(jī)處理后，形成一張總圖。通過這張圖片能很好的識別紅細(xì)胞系統(tǒng)的異常特征。

2.應(yīng)建立細(xì)胞分級標(biāo)準(zhǔn)，對于圖片中某一特征性指標(biāo)，進(jìn)行量化處理，可用百分比統(tǒng)計(特征細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例)。特征細(xì)胞的數(shù)量超出限值，則報告此類細(xì)胞增多。有了量化指標(biāo)，才能避免漏報。

3.不斷提高掃描圖片的質(zhì)量，染色佳、掃描后細(xì)胞分布均勻的數(shù)字化圖片更有利于形態(tài)學(xué)觀察。

［1］Kratz A，Bengtsson HI，Casey JE，et al.Performance evaluation of the CellaVision DM96 system:WBC differentials by automated digital image analysis supported by an artificial neural network［J］.Am J Clin Pathol，2005，124:770-781.

［2］Burthem J，Brereton M，Ardern J，et al.The use of digital'virtual slides'in the quality assessment of haematological morphology:results of a pilot exercise involving UK NEQAS(H)participants［J］.Br J Haematol，2005，130(2):293-296.

［3］Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference leukocyte(WBC)differential count(proportional)and evaluation of instrumental methods;approved standardsecond edition［S］.H20-A2，CLSI，2007.

［4］ 馮仁豐 .實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1996:80.