陳炎添，陳青龍，熊 燕，蘇雪棠，黃偉剛，石 勝，郭翼華，陳榮策

(江門市人民醫(yī)院檢驗科，廣東江門529020)

宮頸癌作為婦科生殖道三大惡性腫瘤之一，嚴重影響女性身心健康及生命安全。我國宮頸癌的發(fā)病率及病死率比較高，年發(fā)病率超過全世界發(fā)病率的30%，每年大約死于宮頸癌的患者約有5萬人［1］。有文獻報道，早期宮頸癌患者的5年治愈率可高達90%，所以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對于宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者有重大的意義［2］。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持續(xù)感染是癌前病變及宮頸癌發(fā)病的重要致病因子［3］，有學者將高危型(higu risk，HR)-HPV DNA檢測作為宮頸癌篩查方法之一［4］。本研究擬探討宮頸液基薄層細胞學檢查(thinprep cytology test，TCT)聯(lián)合 HRHPV DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測在提高宮頸癌前病變的早期診斷中的價值。

材料和方法

一、研究對象

收集2009年10月至2011年9月來江門市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診進行宮頸癌前病變篩查的女性948例，年齡20～65歲，平均年齡41.8歲，所有病例均無子宮頸錐切、急性生殖道炎癥及子宮切除等病史。

二、儀器、試劑及試驗方法

1.HPV DNA PCR 采用廣州中山大學達安基因股份公司生產(chǎn)的核酸擴增儀DA-7600型檢測系統(tǒng)進行PCR擴增、雜交、洗膜及顯色，使用原裝配套試劑HR-HPV(18個型)核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光法)，可同時檢測18種HR-HPV亞型，包括 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4。用宮頸刷置于宮頸口轉(zhuǎn)動4圈，以取得足量的分泌物及脫落細胞，然后將宮頸刷放入備有1 mL洗脫液的專用洗脫管中送檢或保存于-20℃冰箱待測。檢測時將宮頸刷在洗脫管中充分漂洗，把洗脫液全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL微量離心管中，11 600×g離心10 mim，棄去上清液，保留管底的細胞塊。加入50 μL裂解液懸浮沉淀，100℃水浴加熱10 min，11 600×g離心10 min，保留上清液待用。HPV基因擴增:取1 μL DNA抽提液，加入HPV PCR擴增體系，按照試劑盒的擴增程序進行擴增反應(yīng)。導流雜交法進行HPV基因的分型:將20 μL生物素標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)過變性，與1 mL預熱至45℃的雜交緩沖液混合，在導流雜交儀HybriMax上45℃孵育5 min后進行導流雜交。雜交后再用0.8 mL雜交緩沖液沖洗3次。在25℃下用封阻液封阻孵育5 min。封阻后加入0.5 mL酶標液孵育3.5 min。用沖洗緩沖液A沖洗雜交膜，去除未結(jié)合的酶標液，顯色過程中加入0.5 mL四唑硝基藍(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)底物在36℃保持3～5 min或直到顯色完成為止。在顯色后1 h內(nèi)察看分析結(jié)果。

2.TCT 擦去宮頸表面黏液，將宮頸細胞刷插入距宮頸管內(nèi)1 cm處，順時針旋轉(zhuǎn)5圈左右，取出轉(zhuǎn)入細胞保存液中，對于瓶中收集到的細胞經(jīng)Prep 2000系統(tǒng)程序化進行薄片涂片染色，TCT制片后，均由專門醫(yī)師閱片報告。診斷標準采用2001年國際癌癥協(xié)會TBS診斷系統(tǒng):(1)正常范圍;(2)意義不明的非典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)和腺細胞(AGUS);(3)不除外高度鱗狀上皮病變不典型鱗狀細胞(ASC-H);(4)低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL);(5)高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL);(6)鱗狀細胞癌(SCC)和腺癌。

3.病理學檢查 對于TCT以及HR-HPV DNA PCR結(jié)果呈陽性的病例均通過電子陰道鏡下或?qū)m頸錐切下行病理活檢，組織病理學CIN分級按Riehart標準判定診斷結(jié)果。

三、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，本研究數(shù)據(jù)為成對計數(shù)數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、TCT陽性合并HPV陽性者共259例，其中的 AUSCS、LSIL、HSIL、SCC 4 種類型的陽性例數(shù)及HPV感染率，見表1。各組間的HPV感染率、HR-HPV感染率、低危型(LR)-HPV感染率互相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，即隨著癌前病變級別的升高，HR-HPV的感染率亦明顯升高。說明ASCUS和LSIL患者多為HPV陰性或LR-HPV感染的患者，HSIL和SCC患者多為HR-HPV感染的患者，同時提示SCC與HR-HPV感染密切相關(guān)。

二、TCT結(jié)果異常者540例，其中活檢為異常者144例，符合率為26.7%;TCT正常者408例，其中活檢為正常者408例，符合率為100.0%，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

三、活檢確診 CINⅡ級以上者73例，HRHPV陽性66例，敏感性90.4%，TCT陽性60例，敏感性為82.2%，兩者敏感性差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。2種方法聯(lián)合檢測敏感性升高，與TCT和HR-HPV單獨檢測敏感性比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。活檢確診為陰性者804例，HR-HPV檢測陰性。HR-HPV、TCT及HR-HPV和TCT聯(lián)合檢測的陽性預測值分別為25.5%、11.1%、28.2%，陰性預測值分別為 68.8%、 59.2%、40.8%，見表2。

表1 ASCUS、LSIL、HSIL、SCC 4種類型的陽性例數(shù)及HPV感染率的比較

表2 宮頸癌HR-HPV和TCT的敏感性、特異性 (%)

討 論

由于從宮頸癌前病變發(fā)展為宮頸癌是一個時間漫長的過程，如果能及時早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌并給予恰當?shù)奶幚恚瑢m頸癌是可以治愈的。女性在感染HPV后，30% ～50%會出現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)輕度病變，但大部分在感染HPV后轉(zhuǎn)為正常，只有HRHPV持續(xù)感染的女性，才成為宮頸癌的高發(fā)人群［5］。由HR-HPV感染到發(fā)展成為宮頸癌約需9～25年時間，潛伏期長有可能與病毒整合到宿主核基因組適當?shù)奈恢眯枰荛L時間有關(guān)［6］，因此，選擇合理、規(guī)范的宮頸癌早期篩查的方法對于提高其檢出率具有重要意義［7］。目前使用TCT方法能夠采集到頸管細胞，制作時剔除了宮頸黏液和炎性細胞，其清晰度和檢出率均明顯高于常規(guī)的宮頸涂片，但同時也發(fā)現(xiàn)TCT對HPV診斷有一定的漏診率［8］。從本研究結(jié)果可以看出，聯(lián)合檢測TCT和HR-HPV對宮頸癌的檢出率比單獨檢測TCT或HR-HPV高，聯(lián)合檢測方法對診斷宮頸癌具有重要意義。

本研究中TCT陽性的患者，HR-HPV感染率隨著宮頸病變程度的加重呈上升趨勢，從而認為HR-HPV感染與宮頸病變的嚴重程度呈正相關(guān)。宮頸癌的篩查中HR-HPV檢測是一個非常有意義的指標。本研究還發(fā)現(xiàn)，ASCUS與LSIL患者多為HPV陰性或LR-HPV感染的患者，HSIL與SCC患者多為HR-HPV感染的患者，從而說明感染HPV的危險類型與細胞學分級一致，低危型者細胞分化好，高危型者細胞分化差，與文獻［9］報道相類似。

［1］紀麗偉，童婷婷，虞 晴.TCT及陰道鏡下活檢在宮頸疾病中的診斷價值［J］.中國實驗診斷學，2010，14(5):735-737.

［2］Lin M，Yang LY，Li LJ，et al.Genital human papillomavirus screening by gene chip in Chinese women of Guangdong province［J］.Aust N Z J Obstet Gynaecol，2008，48(2):189-194.

［3］Song SH，Lee JK，Seok OS，et al.The relationship between cytokines and HPV-16，HPV-16 E6，E7，and high-risk HPV viral load in the uterine cervix［J］.Gynecol Oncol，2007，104(3):732-738.

［4］周 斌，左新華，傅新文.高危型人乳頭狀瘤病毒16，18型DNA檢測在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價值［J］.檢驗醫(yī)學，2012，27(5):393-395.

［5］宋麗君，陳春麗，羅淑桂.HPV基因分型檢測與宮頸病變的相關(guān)性研究［J］.檢驗醫(yī)學，2012，27(3):163-166.

［6］楊 毅，王友芳，郎景和，等.高危型人乳頭瘤病毒雜交捕獲法Ⅱ評估宮頸上皮內(nèi)瘤變的臨床價值［J］.中國醫(yī)學科學院學報，2006，28(3):395-398.

［7］Ell K，Vourlekis B，Xie B，et al.Cancer treatment adherence among low-income women with breast or gynecologic cancer:a randomized controlled trial of patient navigation［J］.Cancer，2009，115(19):4606-4615.

［8］Patil JB，Kim J，Jayaprakasha GK.Berberine induces apoptosis in breast cancer cells(MCF-7)through mitochondrial-dependent pathway［J］.Eur J Pharmacol，2010，645(1-3):70-78.

［9］Castellsagué X，Drudis T，Ca?adas MP，et al.Human papillomavirus(HPV)infection in pregnant women and mother-to-child transmission of genital HPV genotypes:a prospective study in Spain［J］.BMC Infect Dis，2009，9:74.