趙衛(wèi)衛(wèi)，彭 攸，李曉嬌，盧曉佳，王玉平，劉萃萃，王璐璐，馮 景

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院檢驗科，上海201400)

EZH2基因是人們新近認(rèn)識的一種人類基因，定位于染色體7q35，是一種轉(zhuǎn)錄阻遏因子，可抑制抑癌基因的活性，具有促進(jìn)多種腫瘤的轉(zhuǎn)移特征［1-2］。大量研究表明，乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與EZH2基因密切相關(guān)［3-6］。進(jìn)一步研究表明，miRNAs對 EZH2的表達(dá)有重要的調(diào)控作用［7-8］。miRNA是一種不編碼蛋白的單鏈小分子RNA，其通過完全或不完全地與靶mRNA的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因的翻譯抑制或切割降解，從而調(diào)控基因的表達(dá)［9］。本研究嘗試將 EZH2基因3'UTR序列定向克隆到慢病毒篩選載體上，構(gòu)建攜帶EZH2基因3'UTR的慢病毒篩選載體，在包裝質(zhì)粒的輔助作用下包裝成慢病毒顆粒，并轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，獲得穩(wěn)定表達(dá)EZH2 3'UTR的細(xì)胞株，為后續(xù)的篩選miRNAs奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

293T細(xì)胞株、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(上海中科院提供);pMD19-T載體(TaKaRa公司);CTX靶點篩選系統(tǒng)慢病毒表達(dá)載體及包裝質(zhì)粒(SBI公司);Taq DNA聚合酶、4×dNTP(Promega公司);DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoR I(TaKaRa公司);RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒(QIAGEN公司);Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(碧云天公司);Marker-DL2000、低熔點瓊脂糖(上海生物工程公司)。

二、方法

1.EZH2 3'UTR重組篩選載體的構(gòu)建 查詢PubMed數(shù)據(jù)庫(www.PubMed.com)查找人EZH2 mRNA序列，根據(jù)EZH2 3'UTR序列信息設(shè)計引物。引物序列 上游P5:5'-CT(保護(hù)堿基)GGATCC(劃線部分為BamHI酶切位點)CATCTGCTACCTCCTCC-3'，下游P3:5'-CA(保護(hù)堿基)GAATTC(劃線部分為 EcoRI酶切位點)GATTCAACAAGGACAAGTT-3'。抽提乳腺癌組織總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性 30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。對CTX-Lentivirus空質(zhì)粒和pMD19T-EZH2 3'UTR重組質(zhì)粒分別用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下與16℃連接1h。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，次日挑取菌落進(jìn)行PCR，對于陽性菌落進(jìn)行抽取質(zhì)粒，以BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定后送于上海生工生物工程公司進(jìn)行測序。

2.病毒顆粒的包裝和生產(chǎn) 將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化后，接種到6孔板中。用脂質(zhì)體法將病毒包裝 pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G三質(zhì)?；旌衔?500 ng/μL)7.5μL 和 CTX-EZH2'UTR 慢病毒質(zhì)粒(609 ng/μL)1.2μL共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，混勻后放回到5%CO2培養(yǎng)箱中。6h后，移去細(xì)胞上清，更換為5mL的DMEM完全培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染72 h后的293T細(xì)胞上清，用Real-Time PCR對病毒進(jìn)行滴度測定。CMV上游引物P5:5'-ACGTATTGTCATC-GCTATTACCAT-3'，CMV下游引物 P3:5'-TGGAAATCCCCGTGAGTCAAA-3'，CMV 探針:5'CGCTATCCACGCCCATTGATGTACTGCC-3'。以CMV上下游引物，以 tubulin為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR，檢測病毒滴度。

3.重組慢病毒感染MCF-7細(xì)胞陽性細(xì)胞株的篩選 將細(xì)胞接種于6孔板中，擇合適的感染復(fù)數(shù)(MOI)值，加入適量的病毒，同時加入終濃度為10 μg/mL的 polybrene增強(qiáng)病毒感染。感染24h后換成無病毒和polybrene的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染前進(jìn)行預(yù)實驗，摸索最佳篩選藥物濃度。感染72 h后收集細(xì)胞，將其置于含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中篩選，并進(jìn)行克隆和擴(kuò)增。

4.PCR鑒定重組體在MCF-7細(xì)胞中的整合收集經(jīng)嘌呤霉素篩選的陽性細(xì)胞，提取基因組DNA。根據(jù)慢病毒載體上CMV啟動子的序列設(shè)計引物，陽性細(xì)胞的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共33個循環(huán)。通過PCR鑒定EZH2 3'UTR與MCF-7細(xì)胞基因組整合量。

5.Western blotting檢測慢病毒感染乳腺細(xì)胞株MCF-7后EZH2蛋白表達(dá) 以未感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌細(xì)胞為對照組，細(xì)胞培養(yǎng)后，分別收獲實驗組和對照組細(xì)胞，加入組織細(xì)胞裂解液提取蛋白，配制10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠，上樣量為20 μL，進(jìn)行電泳。恒壓80V至分離膠處后100V至電泳結(jié)束。200mA，1 h將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后EZH2用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，4℃封閉過夜。EZH2一抗工作濃度為1∶300，4℃過夜，actin一抗工作濃度為1∶200，室溫3h。TBST洗膜10 min×3次;加入二抗，工作濃度為1∶300，室溫反應(yīng)2 h 30 min，TBST洗膜10 min×3次。加入化學(xué)發(fā)光底物，暗室壓片，曝光后顯影、定影。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、目的片段EZH2 3'UTR的獲取

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物鑒定，目的片段大小為275bp，與預(yù)期擴(kuò)增的基因片段大小一致，見圖1。

圖1 目的片段EZH2 3'UTR凝膠電泳結(jié)果

二、克隆載體pMD19-T-EZH2 3'UTR的構(gòu)建及鑒定

目的片段EZH2 3'UTR與克隆載體pMD19-T通過連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，次日隨機(jī)挑取6個菌落進(jìn)行PCR鑒定，可見除1個克隆未出現(xiàn)目的條帶外，其余5個均出現(xiàn)目的條帶，大小為275bp，與預(yù)期片段大小相符，見圖2。BamHⅠ、EcoRⅠ雙切酶克隆載體pMD19-T—EZH2 3'UTR后，在電泳下可見275bp處有目的條帶，與預(yù)期片段大小相符，見圖3。

圖2 pMD19-I-EZH2 3'UTR菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 pMD19-T-EZH2 3'UTR雙酶切鑒定

三、重組慢病毒篩選載體 CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR構(gòu)建及鑒定

從AMP+的LB平板上隨機(jī)挑克隆，進(jìn)行菌落PCR鑒定，對于陽性重組子用BamHⅠ、EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，在約10.2Kb處可見線性慢病毒質(zhì)粒和275bp的目的條帶，見圖4，測序結(jié)果顯示目的片段已經(jīng)克隆到慢病毒載體中。

圖4 CTX-Lentivirus-EZH2 3'UTR雙酶切鑒定

四、重組慢病毒顆粒滴度測定

對病毒進(jìn)行裂解后用裂解的病毒上清作為模板，以CMV的上下游P3、P5為引物，進(jìn)行實時定量PCR，做復(fù)管得到CMV1和CMV2的值為1.6×107拷貝/mL和2.1×107拷貝/mL，通過病毒滴度計算公式得到:病毒滴度為4.3×109拷貝/mL。

五、重組慢病毒感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞株后整合量的鑒定

經(jīng)梯度摸索篩選穩(wěn)定整合MCF-7細(xì)胞的最佳濃度為0.2μg/mL。經(jīng)Real-Time PCR檢測，實驗組病毒整合入細(xì)胞基因組的值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。表明重組EZH2 3'UTR慢病毒載體在MCF-7細(xì)胞中很好地與細(xì)胞基因組整合，見圖5。

圖5 MCF-7細(xì)胞中重組慢病毒載體的整合量鑒定

六、Western blotting檢測乳腺癌細(xì)胞MCF-7中EZH2蛋白表達(dá)

Western blotting檢測顯示，在EZH2慢病毒感染實驗組中，EZH2蛋白呈高表達(dá)，而沒有感染EZH2 3'UTR的MCF-7乳腺癌細(xì)胞對照組，則少量表達(dá)EZH2蛋白，見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染慢病毒后EZH2蛋白的表達(dá)

討 論

近年研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控因子PcG蛋白(polycomb group proteins)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［10］，其核心成分EZH2蛋白廣泛受到人們關(guān)注。EZH2通過催化組蛋白H3氨基末端的第27位賴氨酸(H3K27)發(fā)生三甲基化［11］，促進(jìn)或維持染色體的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)，從而沉默癌組織中的抑癌基因的表達(dá)［12］。Raaphorst等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在浸潤性導(dǎo)管癌EZH2表達(dá)明顯增加，表明EZH2是腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期階段的分子事件，直接參與了乳腺癌的演變過程。EZH2高表達(dá)機(jī)制尚不清楚，但大量研究表明miRNAs對EZH2的表達(dá)有重要的調(diào)控作用［7-8］。miRNAs可通過與EZH2基因的3'端非翻譯區(qū)形成堿基配對抑制其表達(dá)。構(gòu)建3'非翻譯區(qū)慢病毒篩選載體為深入了解EZH2與miRNAs相互的關(guān)系顯得非常必要。

慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)來源的一種病毒載體［14-15］，與腺病毒相比，其具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)移片段容量較大，目的基因表達(dá)時間長、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點［15-16］。本實驗所選擇的是長末端重復(fù)序列(LTR)缺失的慢病毒載體，經(jīng)該載體包裝產(chǎn)生的病毒顆粒屬于假型病毒，即病毒感染目的細(xì)胞后不會再感染其他細(xì)胞，也不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒［17］。利用成功構(gòu)建的EZH2基因3'非翻譯區(qū)慢病毒篩選載體，將目的片段EZH2基因3'非翻譯區(qū)整合到MCF-7的基因組中，經(jīng)Real-Time PCR檢測證實，目的片段在乳腺癌MCF-7中穩(wěn)定整合。同時Western blotting檢測顯示，在EZH2慢病毒感染實驗組中，EZH2蛋白呈高表達(dá)，而沒有感染EZH2 3'UTR的空MCF-7細(xì)胞對照組，則低量表達(dá)EZH2蛋白，且該結(jié)果與Kleer等［18］的研究結(jié)果基本一致。

本研究成功構(gòu)建人EZH2基因3'非翻譯區(qū)慢病毒篩選載體，并感染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，使其在乳腺細(xì)胞中穩(wěn)定整合，為miRNAs篩選提供理想的病毒載體，同時該慢病毒載體帶有熒光報告系統(tǒng)，通過熒光報告基因分析，可以很好實現(xiàn)miRNAs與EZH2基因的3'端非翻譯區(qū)的功能驗證。

［1］Weikert S，Christoph F，K?llermann J，et al.Expression levels of the EZH2 polycomb transcriptional repressor correlate with aggressiveness and invasive potential of bladder carcinomas［J］.Int J Mol Med，2005，16(2):349-353.

［2］Yoon KA，Gil HJ，Han J，et al.Genetic polymorphisms in the polycomb group gene EZH2 and the risk of lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2010，5(1):10-16.

［3］Holm K，Grabau D，L?vgren K，et al.Global H3K27 trimethylation and E2H2 abundance in breast tumor subtypes［J］.Mol Oncol，2012，6(5):494-506.

［4］Yoo KH，Hennighausen L.EZH2 methyltransferase and H3K27 methylation in breast cancer［J］.Int J Biol Sci，2012，8(1):59-65.

［5］Gong Y，Huo L，Liu P，et al.Polycomb group protein EZH2 is frequently expressed in inflammatory breast cancer and is predictive of worse clinical outcome［J］.Cancer，2011，117(24):5476-5484.

［6］Varambally S，Dhanasekaran SM，Zhou M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer［J］.Nature，2002，419(6907):624-629.

［7］He LR，Liu MZ，Li BK，et al.High expression of EZH2 is associated with tumor aggressiveness and poor prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma treated with definitive chemoradiotherapy［J］.Int J Cancer，2010，127(1):138-147.

［8］Sander S，Bullinger L，Klapproth K，et al.MYC stimulates EZH2 expression by repression of its negative regulator miR-26a［J］.Blood，2008，112(10):4202-4212.

［9］Bao B，Ali S，Banerjee S，et al.Curcumin analogue CDF inhibits pancreatic tumor growth by switching on suppressor microRNAs and attenuating EZH2 expression［J］.Cancer Res，2012，72(1):335-345.

［10］Gong Y，Huo L，Liu P，et al.Polycomb group protein EZH2 is frequently expressed in inflammatory breast cancer and is predictive of worse clinical outcome［J］.Cancer，2011，117(24):5476-5484.

［11］Chi P，Allis CD，Wang GG，et al.Covalent histone modifications-miswritten，misinterpreted and miserased in human cancers［J］.Nat Rev Cancer，2010，10(7):457-469.

［12］Kawaguchi A，Ochi H，Sudou N，et al.Comparative expression analysis of the H3K27 demethylases，JMJD3 andUTX，withtheH3K27methylase，EZH2，in Xenopus［J］.Int J Dev Biol，2012，56(4):295-300.

［13］Raaphorst FM，Meijat CJ，F(xiàn)ieret E，et al.Poorly differentiated breast carcinoma is associated with increased expression of the human polycomb group EZH2 gene［J］.Neoplasia，2003，5(6):48l-488.

［14］Gay V，Moreau K，Hong SS，et al.Quantification of HIV-based lentiviral vectors:influence of several cell type parameters on vector infectivity［J］.Arch Virol，2012，157(2):217-223.

［15］Lee CL，Dang J，Joo KI，et al.Engineered lentiviral vectors pseudotyped with a CD4 receptor and a fusogenic protein can target cells expressing HIV-1 envelope proteins［J］.Virus Res，2011，160(1-2):340-350.

［16］熊石龍，王 前，包 杰，等.人組織因子RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2008，23(2):187-190.

［17］Baqutti C，Alt M，Schmidlin M，et al.Detection of adeno-and lentiviral(HIV1)contaminations on laboratory surfaces as a tool for the surveillance of biosafety standards［J］.J Appl Microbiol，2011，111(1):70-82.

［18］Kleer CG，Cao Q，Varambally S，et al.EZH2 is a marker of aggressive breast cancer and promotes neoplastic transformation of breast epithelial cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(20):11606-11611.