蔡瑞云， 陳洪亮，金鳳哲

(瑞安市紅十字醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江溫州325200)

腫瘤型M2丙酮酸激酶(TuM2-PK)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤標(biāo)志物，也是研究熱門之一。相關(guān)研究報(bào)道顯示多種腫瘤患者血漿TuM2-PK水平升高，而且與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、淋巴轉(zhuǎn)移存在一定的相關(guān)。目前有關(guān)TuM2-PK對(duì)直腸癌診斷價(jià)值的研究較少。為此，我們檢測(cè)了直腸癌患者血漿TuM2-PK水平，探討TuM2-PK在直腸癌中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集瑞安市人民醫(yī)院和瑞安市紅十字醫(yī)院腫瘤外科2012年3月至12月住院的直腸癌患者153例，男107例，女46例，年齡46～82歲;收集同期直腸良性病變患者48例，其中直腸息肉26例、低級(jí)別直腸上皮內(nèi)瘤變15例、高級(jí)別直腸上皮內(nèi)瘤變7例，男31例，女17例，年齡42～73歲。所有患者均經(jīng)病理診斷證實(shí)，直腸癌患者術(shù)前未接受任何放化療。隨機(jī)選取無(wú)腫瘤史、癌胚抗原(CEA)、癌抗原199(CA199)、癌抗原72-4(CA7-24)正常的健康體檢者32名作為正常對(duì)照組，男20名，女11名，年齡39～72歲。

二、方法

1.樣本收集 所有對(duì)象均于早晨采用EDTAK2抗凝管采集空腹靜脈血2 mL，1 h內(nèi)離心分離出血漿存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.儀器與試劑 儀器為瑞士帝肯TECAN SUNRISE全自動(dòng)酶標(biāo)儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。TuM2-PK采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)，試劑盒由德國(guó)ScheBo ò Biotech AG公司提供，嚴(yán)格按試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，以TuM2-PK＞15 U/mL 判斷為陽(yáng)性結(jié)果［1］。

3.檢測(cè)方法 采用雙抗體夾心ELISA。用純化的人丙酮酸激酶M2型抗體包被微孔板，血漿樣本中的TuM2-PK與之結(jié)合反應(yīng)，再加入HRP標(biāo)記的羊抗人抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后加底物TMB顯色，顏色深淺與樣本中TuM2-PK水平成正比，用酶標(biāo)儀讀取標(biāo)準(zhǔn)液與樣本的吸光度(A)值，檢測(cè)中需制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)液由廠家提供，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)濃度與對(duì)應(yīng)的A值在CURVE EXPERT軟件下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)樣本的A值算出樣本TuM2-PK濃度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組血漿TuM2-PK水平比較

直腸癌組血漿TuM2-PK水平為(26.23±5.36)U/mL，明顯高于直腸良性病變組［(18.52±3.66)U/mL］及正常對(duì)照組［(17.68±4.02)U/mL］(P均＜0.05)。而直腸良性病變組與正常對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

二、直腸癌不同臨床病理參數(shù)間TuM2-PK陽(yáng)性率的比較

直腸癌患者血漿TuM2-PK陽(yáng)性率與腫瘤細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否及臨床TNM分期有關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 直腸癌不同臨床病理參數(shù)TuM2-PK表達(dá)陽(yáng)性率的比較

三、血漿TuM2-PK診斷直腸癌的性能指標(biāo)

以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)直腸癌組與直腸良性病變組TuM2-PK檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行診斷性能分析。血漿TuM2-PK檢測(cè)直腸癌的敏感性為62.09%、特異性為79.16%、陽(yáng)性似然比為2.20、陰性似然比為0.49、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為90.47%、陰性預(yù)測(cè)值為39.58%。

討 論

丙酮酸激酶(PK)是糖酵途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，相對(duì)分子質(zhì)量約為240 000，主要以由4個(gè)亞基組成的四聚體形式存在，有2種結(jié)構(gòu)基因(L基因、M基因)和4種同工酶。4種同工酶通常以酶的活性四聚體形式存在，但在腫瘤細(xì)胞中主要以磷酸化丙酮酸低親和力的二聚體形式存在。這種二聚體的M2型PK被稱為TuM2-PK，與磷酸烯醇丙酮酸親和力很低，因此，會(huì)導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的大量堆積，DNA合成的增加［2］。TuM2-PK在增生細(xì)胞中呈普遍表達(dá)，但在惡性腫瘤中呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，惡性腫瘤這種異常能量代謝是TuM2-PK增高的主要原因。在腫瘤的壞死或轉(zhuǎn)移的過(guò)程中TuM2-PK會(huì)被釋放到外周體液中，因此外周血中可以檢測(cè)到TuM2-PK［3］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在直腸癌組血漿TuM2-PK水平明顯高于直腸良性病變組與正常對(duì)照組(P均＜0.05)，而直腸良性病變組與正常對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。由此可見(jiàn)，確定TuM2-PK的醫(yī)學(xué)決定水平可用于區(qū)別直腸的良、惡性病變，這與盧仁泉［4］等對(duì)胃癌的研究結(jié)果相似。直腸癌患者TuM2-PK的陽(yáng)性率與癌細(xì)胞的分化程度、腫瘤是否有淋巴轉(zhuǎn)移以及臨床病理TNM分期有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤的大小無(wú)關(guān)。雖然TuM2-PK陽(yáng)性率與腫瘤浸潤(rùn)深度之間不存在正相關(guān)關(guān)系，但隨著浸潤(rùn)的加深，TuM2-PK的陽(yáng)性率也呈增加趨勢(shì)。癌細(xì)胞分化程度越低，血漿中TuM2-PK水平就越高;有淋巴轉(zhuǎn)移的患者TuM2-PK陽(yáng)性率高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的患者。在臨床病理TNM分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血漿TuM2-PK陽(yáng)性率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者。這些結(jié)果均明確表明直腸癌患者TuM2-PK水平隨著癌細(xì)胞生物狀態(tài)的改變而改變，一定程度上反映了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究采用ELISA檢測(cè)TuM2-PK，試劑中包被的2種單克隆抗體針對(duì)TuM2-PK不同的位點(diǎn)，避免了與其他PK同工酶的交叉反應(yīng)，保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究發(fā)現(xiàn)TuM2-PK診斷直腸癌的靈敏度、特異性分別為62.09%、72.16%，低于Hardt等［4］的報(bào)道，靈敏度也低于葉維潔等［6］的報(bào)道，但高于其他腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA199等的靈敏度和特異性。

綜上所述，直腸癌患者血漿TuM2-PK水平可在一定程度上代表癌細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)，反映了直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。如果能通過(guò)本地區(qū)大規(guī)模人群的研究，確定TuM2-PK的陽(yáng)性判斷閾值，將有助于提高TuM2-PK的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］Lüftner D，Mesterharm J，Akrivakis C，et al.Tumor type M2 pyruvate kinase expression in advanced breast cancer［J］.Anticancer Res，2000，20(6D):5077-5082.

［2］方偉達(dá)，梁文勇，余其昌.肺癌患者腫瘤M2型丙酮酸激酶的表達(dá)水平及臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19(7):1352-1353.

［3］Mazurek S，Boschek CB，Hugo F，et al.Pyruvate kinase type M2 and its role in tumor growth and spreading［J］.Semin Cancer Biol，2005，15(4):300-308.

［4］盧仁泉，郭 林，許曉峰.胃腸道惡性腫瘤患者血漿腫瘤型M2-丙酮酸激酶測(cè)定及其臨床價(jià)值［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2008，23(4):370-373.

［5］Hardt PD，Ngoumou BK，Rupp J，et al.Tumor M2-pyruvate kinase:a promising tumor marker in the diagnosis of gastro-intestinal cancer［J］.Anticancer Res，2000，20(6D):4965-4968.［6］葉維潔，金冶寧.腫瘤型丙酮酸激酶在結(jié)直腸癌血漿中的測(cè)定及其臨床意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18(3):511-514.