彭賽蛟，李偉林，張 瑾

(1.臺州市中醫(yī)院檢驗科，浙江臺州318000;2.臺州市立醫(yī)院檢驗科，浙江臺州318000)

乙型肝炎是我國最常見的傳染病之一，具有發(fā)病率高、傳染性強和傳播途徑復(fù)雜等特點［1］。按臨床表現(xiàn)的不同，乙型肝炎可分為急性肝炎、慢性肝炎和重型乙型肝炎3種。重型肝炎患者病情嚴重，進展快，死亡率很高［2］，為此，探明重型肝炎發(fā)生和進展的有關(guān)因素對于疾病的治療具有十分重要的意義。有研究表明，乙型肝炎病毒(HBV)感染機體后，對肝臟的損傷主要是免疫損害所致，其中細胞免疫起著主要作用［3-4］，而且細胞毒性T淋巴細胞(CTL)在HBV清除和肝細胞損傷方面均發(fā)揮了重要作用，但上述細胞免疫反應(yīng)在重型肝炎中所起的具體作用還不十分清楚［5-6］。為此，本研究在與不同類型肝炎和健康對照組比較的基礎(chǔ)上，探討了重型乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞亞群及HBV特異性CTL的變化，以期為重型肝炎的發(fā)生及進展研究提供一定的依據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

所有研究對象來自2010年3月至2012年8月期間，在臺州市中醫(yī)院內(nèi)科病房收住入院患者和門診健康體檢者，共122例，其中男96例，女26例，年齡(43±13)歲。共有乙型肝炎患者102例，其中急性乙型肝炎20例、慢性乙型肝炎40例、重型乙型肝炎42例(急性重型乙型肝炎20例，慢性重型乙型肝炎22例)，在重型乙型肝炎患者中死亡患者8例，其余34例患者均好轉(zhuǎn)或康復(fù)出院。健康對照組20名，體檢過程正常，體檢結(jié)果顯示肝功能無異常，無肝炎、血吸蟲病史，各型肝炎病毒抗體陰性。各組研究對象的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

二、方法

1.外周血T淋巴細胞亞群檢測 各組患者的外周血T淋巴細胞亞群采用直接免疫熒光標記全血溶血法和流式細胞儀檢測。各患者于住院次日清晨空腹(體檢患者于體檢當日)經(jīng)肘正中靜脈采血5 mL。將CD3+、CD4+和CD8+熒光標記的單克隆抗體20 μL，分別加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的外周血中，混勻，室溫避光15 min，細胞裂解液溶解紅細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，吸去上清液后加入PBS 500 μL，混勻，待細胞懸浮后，上流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司，美國)檢測。

2.外周血HBV特異性CTL檢測 (1)采用肝素抗凝試管，空腹靜脈采集全血標本5 mL，采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞(PBMC);(2)在PBMC中加入抗HLA-A2異硫氰酸熒光素(FITC)單克隆抗體(BD公司，美國)，采用流式細胞術(shù)快速檢測HLA-A2抗原分型，并用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行驗證;(3)根據(jù)文獻［7］的方法合成3條HLA-A2陽性的HBV特異性CTL抗原表位肽(core18-27、polymerase575-583和envelope335-343)，core18-27短鏈的氨基酸序列為FLPSDFFPSV，polymerase575-583短鏈的氨基酸序列為FLLSLGIHL，envelope335-343短鏈的氨基酸序列為WLSLLVPFV(由中國軍事醫(yī)學科學院提供)。在此基礎(chǔ)上，用藻紅蛋白(PE)進行標記，進一步合成肽段特異性的Tetramer復(fù)合體，即Tc18-27、Tp575-583和 Te335-343;(4)用含有10%胎牛血清的1640液懸浮PBMC，調(diào)整細胞濃度至2×106個/mL。將懸浮液分別加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每孔分別加入10 μL/mL的core18-27、polymerase575-583 和 envelope335-343多肽，每3天行半量換培養(yǎng)液，于培養(yǎng)后第14天收集 HBV肽鏈特異性的 CTL細胞;(5)新鮮EDTA抗凝血分離的PBMC和HBV肽鏈特異性的CTL細胞系均采用PBS洗3次，用200 μL冷PBS懸浮，加入流式細胞儀專用管中，每管106個細胞，然后加入Tc18-27、Tp575-583和Te335-343各2 μL，同時加入CD8-FITC標記的單克隆抗體和CD3-多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP，BD公司，美國)各5 μL，遮光溫育30 min后，多聚甲醛固定6 h上流式細胞儀檢測，采用CellQuest軟件分析結(jié)果。

三、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件和Excel軟件進行處理，采用單因素方差分析和q檢驗分析比較組間差異，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、各組研究對象外周血T淋巴細胞亞群的變化

慢性重型乙型肝炎患者外周血淋巴細胞的CD3+、CD4+、CD8+百分比分別為 66.5 ±2.5、41.0±2.3、34.5±2.2，CD4+/CD8+比值為1.17±0.09。與健康對照組比較，慢性重型乙型肝炎患者外周血淋巴細胞的CD3+和CD4+百分比顯著下降(P＜0.05)，分別降低13.0%和11.5%;外周血淋巴細胞的 CD8+百分比顯著上升(P＜0.05)，上升20.6%;外周血淋巴細胞的CD4+/CD8+比值顯著下降(P＜0.05)，降低27.8%。與急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎患者比較，慢性重型乙型肝炎患者外周血淋巴細胞的 CD3+、CD4+、CD8+百分比和 CD4+/CD8+比值差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。重型乙型肝炎患者中，存活組 CD3+、CD4+、CD8+百分比分別為67.0±2.3、42.5 ±2.2、34.5 ±2.2，CD4+/CD8+比值為1.21 ±0.12;死亡患者組 CD3+、CD4+、CD8+百分比分別為 64.4±2.0、39.1±2.2、36.1±1.9，CD4+/CD8+比值為1.08±0.08。與存活組比較，死亡組的 CD3+、CD4+百分比和 CD4+/CD8+比值降低更加明顯，CD8+百分比上升更加明顯(P ＜0.05)，見表1。

二、各組乙型肝炎患者外周血HBV 3種特異性CTL的變化

與健康對照組比較，慢性重型乙型肝炎患者外周血 core18-27、polymerase 575-583和 envelope335-343特異性CTL水平均明顯下降(P＜0.05);慢性乙型肝炎患者3種CTL水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);急性乙型肝炎患者各種CTL水平明顯上升(P＜0.05);急性重型乙型肝炎患者的外周血core18-27特異性CTL上升明顯，而 polymerase575-583和 envelope335-343特異性CTL與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。死亡組中3種HBV特異性CTL水平下降明顯(P＜0.05)，見圖1和表2。

表1 各組研究對象外周血T淋巴細胞亞群的變化 (%)

圖1 流式細胞術(shù)檢測HBV特異性CTL散點圖

表2 各組研究對象外周血3種特異性CTL的變化 (%)

討 論

以往報道顯示，細胞免疫對于清除細胞內(nèi)HBV起著主要作用［3-4］。本研究結(jié)果顯示，在重型乙型肝炎患者中，慢性重型乙型肝炎患者的CD3+和CD4+細胞百分比出現(xiàn)了明顯的降低，而CD8+百分比出現(xiàn)明顯的增高，CD4+/CD8+比值明顯下降，這表明患者在細胞免疫功能降低的同時，出現(xiàn)了細胞免疫功能的紊亂，但急性重型乙型肝炎患者不明顯。在急性肝炎中，患者T淋巴細胞變化主要表現(xiàn)在CD8+細胞的異常上，而CD4+細胞出現(xiàn)輕度的增加，說明急性期機體應(yīng)激狀態(tài)好，在積極地清除HBV以保護機體;在慢性肝炎中，患者T淋巴細胞變化不僅出現(xiàn)了CD8+細胞的增加，同時還出現(xiàn)了CD4+細胞的降低，說明由于HBV的長期慢性感染，機體逐漸失去了清除HBV的能力，患者病情逐漸加重。當CD8+細胞的增加和CD4+細胞的降低嚴重到一定程度，患者病情迅速惡化，出現(xiàn)慢性重型肝炎，增加了肝炎患者的死亡率。

重型乙型肝炎的發(fā)生還可能與某些基因位點的變異和抗原抗體免疫復(fù)合物的出現(xiàn)有關(guān)，這些因素均可導致由CTL介導的免疫應(yīng)答失調(diào)，這可能與乙型肝炎炎癥加重存在密切的關(guān)系。有研究表明，HBV特異性CTL在清除病毒和引起肝細胞損傷2種不同作用中均可能扮演著關(guān)鍵角色。CTL既可以通過分泌細胞因子等非溶細胞性清除HBV，又可以在不同情況下引起非特異性免疫活性細胞在肝內(nèi)浸潤，最終導致肝細胞受損。如果特異性CTL應(yīng)答失調(diào)，就可能導致慢性重型乙型肝炎的出現(xiàn)。

本研究結(jié)果顯示，慢性重型乙型肝炎患者乙型肝炎 core18-27、polymerase575-583和 envelope335-343特異性CTL水平均明顯下降，慢性乙型肝炎患者各種CTL水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義，急性乙型肝炎患者各種CTL水平與健康對照組比較明顯上升，這與陳瑜等［8］的研究相符合。急性肝炎患者機體處于代償期，其特異性CTL水平的增加有利于HBV的清除，有的藥物能增強特異性細胞免疫功能，如聚乙二醇IFN-α-2b能增強特異性 CD8+細胞的功能［9］，但同時也會導致肝功能的損害，因此，在治療過程中要注意保護肝功能。慢性肝炎患者逐漸失去了對HBV的抵抗能力，專家推測過低的抗原特異性CTL反應(yīng)可能是肝炎病毒感染更容易慢性化的原因之一［10］。當CTL水平出現(xiàn)急劇下降時，機體完全失去了對HBV的抵抗能力，病毒迅速復(fù)制，因此導致慢性肝炎的出現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者HBV DNA水平與HBV特異性CTL有關(guān)，HBV DNA水平低者 HBV特異性 CTL高，HBV DNA水平高者HBV特異性 CTL低［11］。近幾年研究還發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者HBV特異CTL細胞功能與機體調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)和感染不同 HBV 基因型有關(guān)［12-14］。因此，乙型肝炎患者HBV特異性與非特異性T淋巴細胞的變化是一個比較復(fù)雜的課題，搞清乙型肝炎患者體內(nèi)HBV特異性CTL水平對用藥物和乙型肝炎治療性疫苗［15］治療有一定的臨床意義。

由于重型乙型肝炎存在較高的死亡率，所以本研究生存患者和死亡患者的有關(guān)數(shù)據(jù)給予了進一步的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，死亡的重型乙型肝炎患者外周血淋巴細胞CD3+、CD4+百分比和CD4+/CD8+比值降低明顯，CD8+百分比上升明顯;HBV特異性CTL也是如此，慢性重型乙型肝炎患者外周血HBV特異性CTL水平下降更加明顯，說明細胞免疫的異常在重型乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，對于乙型肝炎患者進行外周血T淋巴細胞亞群以及HBV特異性CTL水平的檢測十分重要。動態(tài)檢測他們的水平對于判定乙型肝炎的進展具有重要參考價值［16-17］。當上述檢測指標出現(xiàn)急劇改變時，應(yīng)考慮可能發(fā)生慢性重型乙型肝炎;當慢性重型乙型肝炎患者上述指標進一步發(fā)生改變，提示患者的預(yù)后不良。

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