馬華玲 陳洪雷 朱潤慶 鄭明軍 劉毓玲 范克非 楊為貴

肺鱗癌占原發(fā)性肺癌1/3且有較差的預后，尋找與肺鱗癌預后有關(guān)的生物學指標成為研究的熱點。Caveolin-1［1］參與了各種信號分子和通路的調(diào)控，它與細胞的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。Li等［2］在肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但Caveolin-1與肺鱗癌預后的研究少見。本研究采用免疫組織化學法檢測Caveolin-1在人肺鱗癌、正常肺組織中的表達，分析其與人肺鱗癌臨床病理特征的關(guān)系；同時檢測PCNA在人肺鱗癌中的表達，分析Cavelin-1和PCNA的相關(guān)性，探討Caveolin-1表達在肺鱗癌中的預后意義。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集武鋼總醫(yī)院1998年1月至2008年12月病理存檔蠟塊肺鱗癌43例，正常肺組織16例。入選條件：1）均診斷明確且病理資料及臨床隨訪資料完整；2）腫瘤分化程度，HE染色后由2名病理專家確診。

1.2 臨床資料

43例肺鱗癌中男36例，女7例；高分化18例，中分化12例，低分化13例；ⅠA+ⅠB期17例，ⅡA+ⅡB期10例，ⅢA+ⅢB期16例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例；支氣管殘端有癌3例，支氣管殘端無癌40例。全部病例術(shù)前均未經(jīng)放療、化療。電話或門診隨訪患者出院后情況，隨訪至2011年12月；生存時間以月為單位。16例正常肺組織為距腫塊3 cm以上的肺組織。

1.3 主要試劑和實驗方法

濃縮型兔多抗Caveolin-1購自Santa Cruz公司，工作濃度為1∶100；即用型PCNA和超敏PV9000免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

Caveolin-1、PCNA抗原修復均采用微波修復，其余步驟嚴格按照PV-9000二步法說明書進行，用PBS代替一抗做空白對照；肺鱗癌陽性片為陽性對照，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水透明封片。

1.4 免疫組織化學結(jié)果判定

Caveolin-1以細胞質(zhì)/膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；參照文獻［3］結(jié)合陽性細胞百分比及染色強弱評分，陽性細胞計數(shù)：≤10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。染色強度分類：陰性，0分；弱，1分；中等，2分，強，3分。兩者計分相乘＞2分者為陽性。PCNA以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；計數(shù)至少500個腫瘤細胞，計算陽性率，陽性率＞20%的為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS16.0軟件，采用χ2檢驗和精確概率法分析Caveolin-1、PCNA表達與病理特征之間的關(guān)系，Caveolin-1與PCNA的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗比較組間的差異。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Caveolin-1、PCNA在人肺鱗癌中的表達

正常肺組織中Caveolin-1的陽性表達位于肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞，而支氣管黏膜上皮不表達（圖1A）；肺鱗癌組織中Caveolin-1的陽性表達位于癌細胞胞質(zhì)或胞膜內(nèi)（圖1B），并在分化好的鱗癌癌巢周邊基底樣細胞中的表達強于癌巢中央的細胞（圖1C）。43例肺鱗癌組織中Caveolin-1的陽性率（44.19%）顯著低于16例正常肺組織（100%，P＜0.001）。PCNA的陽性表達位于細胞核（圖2），在人肺鱗癌中PCNA的陽性率為53.49%（23/43）。

圖1 Caveolin-1的表達Figure1 Caveolin-1 expression in normal lung tissues and lung squamous cell carcinoma

圖2 PCNA在肺鱗癌中的表達（PV9000×200）Figure2 PCNA expression in lung squamous cell carcinoma（PV9000×200）

2.2 Caveolin-1的表達與人肺鱗癌病理特征的關(guān)系

Caveolin-1陽性率隨臨床分期的上升而升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.018）；Caveolin-1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.006）。Caveolin-1表達與肺鱗癌患者性別、年齡、分化程度、支氣管殘端有無癌殘留均無關(guān)（P＞0.05）。Caveolin-1在PCNA（+）病例的陽性率高于PCNA（-）病例，兩者表達呈正相關(guān)（r=0.360，P=0.018，表1）。

2.3 生存分析

2.3.1 Caveolin-1對人肺鱗癌患者生存預后的影響 患者隨訪至2011年12月，30例死亡，13例截尾。對Caveolin-1不同表達的肺鱗癌患者生存時間進行Kaplan-Meier統(tǒng)計顯示：Caveolin-1陽性表達患者的生存時間顯著低于Caveolin-1陰性表達者（P=0.007，圖3）。對24例Caveolin-1不同表達的無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者生存時間行Kaplan-Meier統(tǒng)計顯示：Caveolin-1陽性表達的患者生存時間顯著低于Caveolin-1陰性表達者（P=0.002，圖4）。對19例Caveolin-1不同表達的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺鱗癌患者生存時間行Kaplan-Meier統(tǒng)計顯示：Caveolin-1陽性表達患者的生存時間與Caveolin-1陰性表達者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.333）。

2.3.2 單因素分析 單因素Cox生存分析結(jié)果顯示：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時間顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P=0.008）；支氣管殘端有癌殘留的患者生存時間顯著低于支氣管殘端無癌殘留者（P＜0.001）；且隨患者TNM分期的升高，患者生存時間顯著下降（P=0.001）；PCNA表達陽性的患者生存時間顯著低于PCNA表達陰性者（P=0.011）。而患者的性別、年齡及分化程度與肺鱗癌患者生存時間無關(guān)（P＞0.05）。

2.3.3 多因素分析 將單因素分析中與患者生存時間相關(guān)的因素進行多因素分析。結(jié)果顯示，Caveolin-1表達、TNM分期、支氣管殘端有無癌殘留是肺鱗癌的獨立預后因素；而患者淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、PCNA表達不是肺鱗癌的獨立預后因素（表2）。

表1 人肺鱗癌組織中Caveolin-1的表達與臨床病理特征的關(guān)系 例Table1 Relationship between Caveolin-1 expression and clinicopathological features in lung squamous cell carcinoma

圖3 43例肺鱗癌組織中Caveolin-1（+）組和Caveolin-1（-）組的生存曲線Figure3 Kaplan-Meier curves of 43 patients categorized into having Caveolin-1-positive and-negative expression

圖4 24例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組中Caveolin-1（+）和Caveolin-1(-)組的生存曲線Figure4 Kaplan-Meier curves showing shorter survival times for Caveolin-1-positive than Caveolin-1-negative patients without lymph node metastasis

表2 多因素Cox統(tǒng)計分析結(jié)果Table2 Results of Cox multivariate regression analysis

3 討論

Caveolin-1作為腫瘤抑制因子，其在肺癌［4］、乳腺癌［5］中表達下調(diào)，本研究亦發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在肺鱗癌組織中的表達顯著低于正常肺組織；導致Caveolin-1在肺鱗癌中失活的原因及途徑尚不清楚，可能與Caveolin-1突變、雜合性缺失、過甲基化有關(guān)［6］。本研究還發(fā)現(xiàn)正常肺組織中的支氣管黏膜和化生的鱗狀上皮中均不表達Caveolin-1，此結(jié)果提示肺鱗癌中Caveolin-1的表達與正常支氣管黏膜無關(guān)；具體機理有待進一步研究。相對于正常肺組織而言，Caveolin-1在肺癌組織中總體表達下降，但本研究表明隨著肺鱗癌臨床分期的增高，Caveolin-1表達亦顯著增高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組Caveolin-1的表達顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；這與Chen等［4］在肺癌中的報道一致。至于Caveolin-1在肺鱗癌中表達的雙面性，可能由于作為信號傳導樞紐的Caveolin-1作用比較復雜，蛋白表達量可能會表現(xiàn)出不同的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)Caveolin-1在分化好的肺鱗癌癌巢周邊基底樣細胞中的表達強于癌巢中央的細胞，該結(jié)果提示Caveolin-1可能通過癌巢外周的基底樣細胞與癌間質(zhì)細胞作用促進腫瘤擴散。本研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1與PCNA的表達呈正相關(guān)。提示在肺鱗癌中Caveolin-1的異常表達可能亦通過刺激細胞增殖調(diào)控該腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。

Caveolin-1參與細胞增殖、新生血管生成，與腫瘤預后相關(guān)［7］。Du等［8］對Caveolin-1不同表達的鼻咽癌患者生存時間進行Kaplan-Meier統(tǒng)計顯示：Caveolin-1陽性表達患者的生存時間顯著低于Caveolin-1陰性表達者。Ando等［9］對食管鱗癌的研究顯示Caveolin-1陽性表達患者的生存時間顯著低于Caveolin-1陰性表達者。本研究亦顯示Caveolin-1陽性表達患者的生存時間顯著低于Caveolin-1陰性表達者，提示Caveolin-1表達上調(diào)為腫瘤預后的不良因素；進而對24例Caveolin-1不同表達的無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時間進行生存分析顯示，Caveolin-1陽性表達的患者生存期顯著低于Caveolin-1陰性表達者；對19例Caveolin-1不同表達的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者生存時間進行生存分析顯示，Caveolin-1陽性表達與Caveolin-1陰性表達患者的生存時間差異無統(tǒng)計學意義。該結(jié)果與Horiguchi等［10］在腎癌中的研究結(jié)果一致，提示Caveolin-1陽性表達的原發(fā)性肺鱗癌有侵襲轉(zhuǎn)移的風險，Caveolin-1陽性患者術(shù)后應(yīng)密切隨訪。對切除的肺鱗癌組織標本進行Caveolin-1檢測，具有一定的臨床應(yīng)用前景。

單因素生存分析顯示，患者的生存時間與TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、PCNA狀態(tài)和支氣管殘端有無癌殘留有關(guān)。提示TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)和PCNA狀態(tài)相對于其它臨床病理因素而言對于肺鱗癌患者的預后具有更大的影響。手術(shù)的徹底性對于肺鱗癌患者的預后意義亦較大，故提倡手術(shù)治療肺鱗癌時應(yīng)盡最大可能的切除病灶。PCNA作為DNA聚合酶的輔助蛋白，能夠客觀地反映的惡性增殖分數(shù)和生長速度。研究［11］認為PCNA在一定程度上反映腫瘤惡性程度，對于分析判斷腫瘤的預后有重要意義。多因素生存分析顯示，Caveolin-1表達、TNM分期、支氣管殘端有無癌殘留是影響肺鱗癌患者生存時間的顯著因素，該結(jié)果與Cho等［12］在上尿路移行細胞癌的研究結(jié)果類似。因此，本研究認為Caveolin-1表達、TNM分期和支氣管殘端有無癌殘留可作為判斷肺鱗癌的預后指標。

綜上所述，Caveolin-1參與與細胞惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達水平與肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后有著密切的關(guān)系。Caveolin-1有可能成為指導肺鱗癌診斷和判斷預后的一個重要生物學指標。

1 Burgermeister E,Liscovitch M,R?cken C,et al.Caveats of Caveolin-1 in cancer progression[J].Cancer Lett,2008,268(2):187-201.

2 Li M,Chen H,Diao L,et al.Caveolin-1 and VEGF-C promote lymph node metastasis in the absence of intratumoral lymphangiogenesis innon-small cell lung cancer[J].Tumori,2010,96(5):734-743.

3 Joo HJ,Oh DK,Kim YS,et al.Increased expression of Caveolin-1 and microvessel density correlates with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma[J].BJU Int,2004,93(3):291-296.

4 Chen HL,Fan LF,Gao J,et al.Differential expression and function of the Caveolin-1 gene in non-small cell lung carcinoma[J].Oncol Rep,2011,25(2):359-366.

5 Witkiewicz AK,Dasgupta A,Sotgia F,et al.An absence of stromal Caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in humanbreast cancers[J].Am J Pathol,2009,174(6):2023-2034.

6 Williams TM,Lisanti MP.Caveolin-1 in oncogenic transformation,cancer,and metastasis[J].Am J Physiol Cell Physiol,2005,288(3):C494-C506.

7 Nohata N,Hanazawa T,Kikkawa N,et al.Caveolin-1 mediates tumor cell migration and invasion and its regulation by miR-133a in head and necksquamous cell carcinoma[J].Int J Oncol,2011,38(1):209-217.

8 Du ZM,Hu CF,Shao Q,et al.Upregulation of Caveolin-1 and CD147 expression in nasopharyngeal carcinoma enhanced tumor cell migrationand correlated with poor prognosis of the patients[J].Int J Cancer,2009,125(8):1832-1841.

9 Ando T,Ishiguro H,Kimura M,et al.The overexpression of Caveolin-1 and caveolin-2 correlates with a poor prognosis and tumor progression inesophageal squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep,2007,18(3):601-609.

10 Horiguchi A,Asano T,Asakuma J,et al.Impact of Caveolin-1 expression on clinicopathological parameters in renal cell carcinoma[J].J Urol,2004,172(2):718-722.

11 Kato K,Kawashiri S,Yoshizawa K,et al.Expression form of p53 and PCNA at the invasive front in oral squamous cell carcinoma:correlation withclinicopathological features and prognosis[J].J Oral Pathol Med,2011[Epub ahead of print].

12 Cho DS,Yim H,Cho KS,et al.Impact of Caveolin-1 expression on the prognosis of transitional cell carcinoma of the upper urinary tract[J].J Korean Med Sci,2008,23(2):296-301.