屈洪波 范原銘 韓明利 陳 鑫 吳誠義 湯為學

低氧微環(huán)境不僅參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲轉移及血管生成等調控，而且亦抑制腫瘤干細胞及腫瘤相關間質干細胞分化［1-2］。盡管目前尚未獲得腫瘤干細胞特異性標志物，但特殊的腫瘤微環(huán)境，尤其是低氧微環(huán)境可作為腫瘤干細胞治療靶點。研究表明，HIF-2α在維持腫瘤干細胞未分化表型中發(fā)揮重要作用［3］。下調HIF-2α介導的低氧信號通路將抑制腫瘤干細胞自我更新及增加對放、化療敏感性。本研究擬探討沉默HIF-2α對低氧下BCSCs微球體富集的抑制作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株及主要試劑：乳腺癌MCF-7細胞（中科院上海細胞庫）；慢病毒質粒pGC-LV、pHelper1.0及pHelper2.0（上海吉凱基因公司）；Lipofectamine2000（美國 Invitrogen公司）；B27（1∶50）、胎牛血清及DMEM/F12（美國Gibco公司）；堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）及表皮生長因子（EGF）（以色列ProSpec公司）；單克隆鼠抗人HIF-2α及β-actin（美國Santa Cruz公司）；HRP標記抗鼠二抗（北京中杉金橋公司）；總蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒及Marker（大連寶生物公司）；PCR引物設計及合成（上海生工公司）。

1.2 方法

1.2.1 低氧下BCSCs微球體培養(yǎng) 取對數生長期MCF-7細胞，消化后重懸于添加生長因子的無血清培養(yǎng)基（serum-free medium，SFM）。SFM按常規(guī)方法配制：DMEM/F12中添加5 U/L胰島素、L-谷氨酰胺2 mmol/L、B27為1∶50、EGF 20 μg/L及BFGF 20μg/L。調整細胞密度至3×104/mL后接種于低粘附6孔板，置于低氧培養(yǎng)箱中，每3天半量或全量換液1次，約10 d傳代 1 次。低氧培養(yǎng)箱由 1%O2、94%N2、5%CO2組成，通過控制O2或N2輸入量，維持低氧微環(huán)境。

1.2.2 HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體構建及鑒定 設計及合成HIF-2α基因siRNA寡核苷酸序列，構建干擾序列表達質粒，轉染至293T細胞，根據HIF-2α抑制率，確定最終有效靶序列為5'-GTGA GAGTGAGTAAGGGTA-3'，由上海吉凱基因公司合成。寡核苷酸經退火形成雙鏈DNA，經T4連接酶與Age I和EcoR I雙酶切后的pGC-LV-GFP線性化載體連接，形成表達siRNA慢病毒載體，經酶切鑒定。轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選取重組陽性克隆行PCR鑒定。

1.2.3 MCF-7細胞轉染 取對數生長期MCF-7細胞及第1代BCSCs微球體消化后計數，2×105/mL細胞接種于6孔板中，低氧下培養(yǎng)至30%～50%匯合時，按感染指數（MOI=20）加入HIF-2α基因RNA干擾慢病毒液，以空載體作為對照，48 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況。2周后采用流式細胞術分選綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）陽性細胞。

1.2.4 RT-PCR和Western blot檢測HIF-2α mRNA及蛋白表達 實驗分為RNA干擾組（20%O2）、RNA干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）。收集各組GFP（+）的MCF-7細胞，Trizol試劑抽提總RNA，逆轉錄反應得到cDNA。以β-actin為內參，檢測HIF-2α mRNA表達。引物設計：β-actin上游引物為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；HIF-2α上游引物為5'-ATGGTAGCCCTCTCCAACAAG-3'，下游引物為5'-AGGTTCTTCATCCGTTTCCAC-3'。設置反應參數：95℃預變性15 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸5 min，共進行35個循環(huán)。實驗重復3次，取平均值。收集各組細胞后，加入RIPA裂解液及PMSF，冰上靜置30 min；12 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行電泳，電轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h，加一抗，4℃孵育過夜。HRP標記的抗山羊或鼠二抗37℃孵育1.5 h，TBST洗膜后以ECL發(fā)光試劑盒顯影并曝光，實驗重復3次，取平均值。

1.2.5 MTT檢測MCF-7細胞增殖活性 實驗分組同前，取對數生長期MCF-7細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔，分別在常氧和低氧下培養(yǎng)，于24、48、72、96 h加入20 μL/孔MTT（5 μg/L），培養(yǎng)4 h后棄上清，加入150 μL DMSO，酶標儀570 nm測OD值，計算5個復孔平均值。細胞增殖抑制率（%）=（對照孔OD值-實驗孔OD值）/對照孔OD值×100%。

1.2.6 有限稀釋法檢測低氧下微球體細胞單克隆形成能力 實驗分組同前，將空載體組及RNA干擾組慢病毒載體轉染至第1代BCSCs微球體細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，收集第2代微球體細胞，用Accutase細胞消化液消化成單個細胞，應用SFM倍比稀釋至5個/mL，接種至96孔板，置于低氧下培養(yǎng)，第2天在顯微鏡下挑選只含1個細胞的孔，做好標記并補加100 μL添加生長因子的SFM；隔天觀察直徑＞75 μm或50個細胞以上克隆微球體數量，由于1個微球體代表1個干細胞起源的克隆，以微球體形成率（%）=微球體數/接種細胞數×100%計算克隆形成率。

1.2.7 RT-PCR檢測微球體細胞干細胞相關標志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達 實驗分組同前，細胞懸液離心后收集微球體，Trizol試劑常規(guī)抽提總RNA，逆轉錄反應得到cDNA。以β-actin為內參，檢測ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達。引物設計：β-actin上游引物為5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，下游引物為5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'；ABCG2 上游引物為5'-AGAGTGGCTTTCTACCTTGTCG-3'，下游引物為5'-AATAACGAAGATTTGCCTCCAC-3'；CD44上游引物為5'-CATCTACCCCAGCAACCCTA-3'，下游引物為5'-ACTGTCTTCGTCTGGGATGG-3'；OCT-4上游引物為5'-GTATTCAGCCAAACGACCATCT-3'，下游引物為5'-TACTGGTTCGCTTTCTCTTTC G-3'。余下步驟同前（1.2.4所述），實驗重復3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HIF-2α基因RNA干擾慢病毒載體PCR鑒定及轉染

將HIF-2α基因RNA干擾載體轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，選取重組陽性克隆行PCR鑒定。陽性重組細菌克隆PCR產物大小為343 bp，以雙酶切后pGC空載體PCR產物大小289 bp為陰性對照，鑒定結果與預期相符（圖1）。將RNA干擾慢病毒液加至培養(yǎng)的MCF-7細胞，12 h后更換為完全培養(yǎng)基，48 h后可見綠色熒光蛋白表達，且表達量隨時間遞增，72 h時達最大，轉染效率＞80%，可用于后續(xù)實驗。

1 and 2：Negative clone group（289 bp）；3 and 4：Positive clone group（343 bp）；5 and 6：Empty vector group（289 bp）；7：Negative control group（ddH2O）；M：Marker

2.2 低氧及常氧下MCF-7細胞HIF-2α mRNA及蛋白表達

RT-PCR結果顯示：RNA干擾組（20%O2）、RNA干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）細胞HIF-2α mRNA表達量分別為 0.005±0.001、0.008±0.001、0.785±0.137及0.831±0.232，與空載體組比較，低氧及常氧下RNA干擾組HIF-2α mRNA表達均明顯降低（P＜0.05，圖2A）。

Western blot結果顯示：RNA干擾組（20%O2）、RNA 干擾組（1%O2）、空載體組（20%O2）及空載體組（1%O2）細胞HIF-2α蛋白表達量分別為0.062±0.012、0.065±0.021、0.175±0.131及0.376±0.236，與空載體組比較，低氧及常氧下RNA干擾組HIF-2α蛋白表達均顯著降低（P＜0.05，圖2B）。

圖2 RT-PCR和Western blot檢測各組MCF-7細胞中HIF-2α mRNA及蛋白表達Figure2 HIF-2α mRNA and protein expressions in MCF-7 cells from different groups,as detected by RT-PCR and Western blot,respectively(±s,n=3)

2.3 沉默HIF-2α對低氧下MCF-7細胞增殖活性的影響

MTT結果顯示：常氧下RNA干擾組與空載體組及未轉染組之間細胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明 RNA 干擾 HIF-2α基因對常氧下MCF-7細胞增殖活性無影響。而低氧下RNA干擾組較未轉染組及空載體組，細胞增殖活性明顯受到抑制（P＜0.05，圖3）。

圖3 MTT法檢測各組MCF-7細胞增殖抑制率Figure3 Proliferation inhibition rate of MCF-7 cells in different groups as determined by the MTT assay

2.4 沉默HIF-2α對低氧下BCSCs微球體形成的影響

倒置熒光顯微鏡結果顯示，未轉染組，空載體組及RNA干擾組BCSCs微球體數量分別為（16±5）、（13±2）及（5±1）個，與未轉染組及空載體組比較，RNA干擾組MCF-7細胞成球率降低60%（P＜0.05，圖4A～C）。轉染組和空載體組微球體平均直徑為（225.6±3.2）μm和（189.6±2.1）μm，而RNA干擾組微球體平均直徑為（84.4±1.2）μm，RNA干擾組微球體平均直徑明顯降低（P＜0.05，圖4D～F）。

圖4 熒光顯微鏡下觀察低氧下各組MCF-7細胞微球體形成情況Figure4 Microsphere formation of MCF-7 cells for different groups under hypoxia，as observed by fluorescent microscopy

2.5 沉默HIF-2α對低氧下BCSCs相關標志物mRNA表達影響

RT-PCR結果顯示：低氧下RNA干擾組、空載體組及未轉染組細胞ABCG2 mRNA表達量分別為0.446±0.120、0.898±0.211及 0.865±0.126；CD44 mRNA表達量分別為 0.325±0.056、0.989±0.316及0.956±0.289；OCT-4 mRNA表達量分別為 0.517±0.214、0.843±0.231及0.817±0.211。與未轉染組及空載體組比較，RNA干擾組BCSCs相關標志物ABCG2、CD44及OCT-4 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05，圖5），表明沉默HIF-2α表達能有效下調BCSCs相關標志物表達。

圖5 RT-PCR檢測各組BCSCs相關標志物mRNA表達Figure5 mRNA expressions of the BCSC markers in different groups，as assayed by RT-PCR

3 討論

低氧在腫瘤中普遍存在，腫瘤低氧抑制細胞分化、上調耐藥基因表達、選擇性抗凋亡、促進侵襲轉移、下調DNA修復基因表達及增加基因不穩(wěn)定性等［4-5］。隨著腫瘤干細胞及其腫瘤相關微環(huán)境研究深入［6］，研究表明，低氧不僅增強腫瘤干細胞致瘤性，同時在維持腫瘤干細胞處于未分化表型及表觀遺傳學修飾等發(fā)揮重要作用［3，7-8］。

低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIFs）為近年來發(fā)現的一類介導哺乳動物細胞內低氧反應的核轉錄復合體，廣泛表達于哺乳動物的各種組織細胞中，以促進有機體對低氧的適應過程，是細胞在基因轉錄水平協(xié)調缺氧變化的最主要調節(jié)因子［9-10］。HIFs家族包括兩個重要成員，即HIF-1α和HIF-2α，兩者在功能上相似，但不完全相同［3］。其組成均含有結構亞單位（HIF-β）和功能亞單位（HIF-α）兩部分。常氧下，HIF-α易受泛素-蛋白酶快速降解。低氧下HIF-α因無法羥基化而未被降解，與從胞漿轉移到核內HIF-β結合形成二聚體，啟動靶基因表達產生多種生物學效應。本研究發(fā)現，常氧下存在HIF-2α mRNA表達，但是在蛋白水平未見其表達，可能是常氧下HIF-2α蛋白被降解而喪失作用；而低氧可誘導HIF-2α蛋白表達，且泛素化降解途徑受抑制；同時非氧依賴途徑也可誘導HIF-2α蛋白合成［11］。MTT結果也驗證此結論，常氧下RNA干擾組與空載體組之間細胞增殖抑制率無明顯差異，表明盡管常氧下存在HIF-2α mRNA轉錄，但在翻譯階段出現降解。而沉默HIF-2α表達可明顯抑制低氧下細胞增殖，且HIF-2α蛋白表達降低，表明HIF-2α具有抗凋亡作用。其抗凋亡的可能機制［12］：1）激活下游VEGF、NOS等促進腫瘤血管生成；2）誘導p21和p27的活化，阻斷細胞G1/S期轉換，使細胞停滯在G1期；3）誘導p53基因突變及抑制Bcl-2表達；4）增加無氧代謝和葡萄糖攝取。

HIF-2α除具有與HIF-1α相似作用外，還在維持腫瘤干細胞未分化表型方面發(fā)揮重要作用。Li等［13］發(fā)現膠質瘤干細胞高表達HIF-1α和或HIF-2α，沉默HIF-1α或HIF-2α可降低神經球形成及影響膠質瘤干細胞生存，與HIF-1α相比，HIF-2α在膠質瘤干細胞中表達更高。同樣，Pietras等［14］發(fā)現HIF-2α優(yōu)先表達于未成熟神經脊樣神經母細胞瘤中，并維持神經母細胞瘤未分化狀態(tài)。Hochedlinger等［15］在多西環(huán)素誘導轉基因小鼠模型中，發(fā)現OCT-3或OCT-4高表達能抑制細胞分化，導致上皮組織發(fā)育不良，表明OCT-3或OCT-4參與誘導腫瘤生成；同時將HIF-2α敲入小鼠胚胎細胞后，結果顯示HIF-2α與OCT-3或OCT-4在轉錄水平上直接相關，而OCT-3或OCT-4轉錄因子的丟失將使得鼠胚胎干細胞源性畸胎瘤生長減慢。

本研究通過RNA干擾沉默HIF-2α在BCSCs微球體細胞中表達，發(fā)現微球體形成率及大小均明顯降低，同時BCSCs相關標志物表達也明顯降低，表明HIF-2α可能是調控乳腺癌細胞“干性”的重要因子，低氧具有維持BCSCs未分化表型作用。

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