單莉婭，張?jiān)迫A，朱美意，朱井玲，汪海燕，黃瑾

雞胚背根神經(jīng)節(jié)的摘取方法及培養(yǎng)條件的改進(jìn)優(yōu)化

單莉婭，張?jiān)迫A，朱美意，朱井玲，汪海燕，黃瑾

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832002）

探討摘取雞胚DRG的有效方法，并對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為神經(jīng)營養(yǎng)因子突起鑒定奠定基礎(chǔ)。根據(jù)雞胚DRG的生長狀態(tài)和解剖特點(diǎn)，采用分部摘取法摘取雞胚DRG，利用NGF對不同部位的DRG進(jìn)行鑒定，同時通過不同血清濃度、不同培養(yǎng)基及不同觀察時間雞胚DRG神經(jīng)突起的生長狀態(tài)，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示分部摘取法摘取雞胚DRG提高了實(shí)驗(yàn)的可操作性和可重復(fù)性；綜薦骨部的雞胚DRG為實(shí)驗(yàn)最佳取材部位；無血清RPMI－1640培養(yǎng)基為最適神經(jīng)突起生長鑒定培養(yǎng)基。

雞胚背根神經(jīng)節(jié)；神經(jīng)營養(yǎng)因子；生物活性

雞胚背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）組織培養(yǎng)檢測法作為神經(jīng)營養(yǎng)因子活性檢測的經(jīng)典方法［1］，具有實(shí)驗(yàn)條件要求簡單，特異性高，整體性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確、直觀地反映出神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)。但該方法也有其不足之處，首先是可操作性差，由于DRG剝離困難，根據(jù)傳統(tǒng)方法及相關(guān)文獻(xiàn)，很難得到大量的雞胚DRG，且文獻(xiàn)中關(guān)于雞胚DRG的摘取方法缺少系統(tǒng)描述，需要浪費(fèi)大量的時間進(jìn)行摸索與探討；其次是可重復(fù)性差，由于不同部位的神經(jīng)節(jié)，其生長狀態(tài)、細(xì)胞狀態(tài)存在不均一性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。

針對以上關(guān)鍵問題，我們參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)［2－4］，首先對雞胚 DRG 的取材方法進(jìn)行了細(xì)化，其次針對因?yàn)槿〔牟课徊煌瑢?dǎo)致的可重復(fù)性差的問題進(jìn)行了探討，根據(jù)不同部位神經(jīng)節(jié)的不同生長狀態(tài)與解剖結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分部摘取，摸索出各部位的取材方法，并利用神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）對該方法的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。同時，通過對培養(yǎng)基選擇、血清濃度的確定、培養(yǎng)時間等關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了較理想的用于神經(jīng)突起鑒定的雞胚DRG的摘取方法及培養(yǎng)條件，為雞胚DRG神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)及神經(jīng)營養(yǎng)因子活性檢測奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

孵化第9天的受精雞蛋，購自新疆石河子市富強(qiáng)孵化廠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器械和試劑

顯微眼科剪，顯微眼科鑷，解剖顯微鏡（Nikon，SMZ645），37～45℃恒溫孵育箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠），CO2恒溫培養(yǎng)箱（For ma Scientific），超凈臺（大連瑞欣實(shí)驗(yàn)室科技有限公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，數(shù)碼相機(jī)（CASIO，EX-H30）；實(shí)驗(yàn)試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO，31800），DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO，12800），胎牛血清FBS（GIBCO，1108862），Collagen from rat tail（Sig ma，C7661），Reco mbinant Hu man β-NGF（Pepr otech，020760），Super-Bradf or d Protein Assay Kit（Cwbio，CW0013）。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的孵化

購買新鮮的受精雞蛋，置于38℃恒溫孵育箱孵化，每天翻轉(zhuǎn)1次。孵化期間，溫箱下層放1盆水，以維持溫箱中的一定濕度。

1.2.2 雞胚DRG的摘取

將孵化9 d的受精雞蛋置于無菌室潔凈工作臺上，先用酒精棉球消毒外殼，用鑷子從氣室端敲破蛋殼并勾出雞胚，放入無菌培養(yǎng)皿中，若血液新鮮，胸腔內(nèi)有心臟跳動，即為活胚，適于實(shí)驗(yàn)；然后展開雞胚肢芽，緊靠驅(qū)體處用眼科剪將頭剪去，依次切開腹側(cè)體壁，取出臟器，清除組織碎片，完全暴露脊柱和兩側(cè)骨骼，在距離脊柱3-5 m處用眼科剪剪去兩側(cè)肢體，與一半肋骨，并將剪好的脊柱放入含有磷酸鹽緩沖液（PBS）的培養(yǎng)皿中，按以下步驟在解剖顯微鏡下摘取DRG：（1）用顯微眼科鑷去除脊柱腹側(cè)與背側(cè)的組織；（2）以胸椎兩側(cè)留下的肋骨為標(biāo)志，將胸椎與綜薦骨分開，分別取胸椎部位與綜薦骨部位的DRG；（3）胸椎部DRG的摘?。喝コ刈祪蓚?cè)的肋骨及組織碎片，沿椎管輕輕夾掉椎板，暴露脊髓，去除脊髓，此時胸椎相鄰椎間孔部位，可見到小圓泡狀DRG，逐個摘取并放入盛有RPMI-1640培養(yǎng)液的玻璃皿中以備培養(yǎng)之用；（4）綜薦骨部DRG的摘?。阂?yàn)榫C薦骨部位的DRG大多為椎間孔外型，在去除兩側(cè)盆骨時容易被一并摘除，所以要注意先剪斷脊柱兩側(cè)DRG匯聚成的坐骨神經(jīng)，再輕輕將兩側(cè)盆骨摘除，此時用顯微眼科鑷逐個摘取，并放入盛有培養(yǎng)液的玻璃皿中以備培養(yǎng)之用；（5）尾椎部DRG的摘?。何沧挡緿RG體積小，被椎骨側(cè)突包裹，需夾斷側(cè)突逐個摘取，且摘取難度大，摘取過程中易損壞，因此要十分小心。

1.2.3 培養(yǎng)板的準(zhǔn)備

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加0.05 mg／mL Collagen from rat tail 50μL（四周的孔不用于實(shí)驗(yàn)，所以不加），開蓋在超凈臺紫外線下過夜晾干，用PBS洗3次后直接使用。

1.2.4 雞胚DRG鑒定

將分離出來的胸椎、綜薦骨和尾椎的雞胚DRG按照部位的不同，分成3組，置于含有RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)24 h后，接種于包被有Collagen fr o m rat tail的96孔板中，每孔1個DRG，每組5個復(fù)孔，每組的實(shí)驗(yàn)組加入NGF使其終濃度為50 ng／mL，空白組加入等體積PBS，培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡下觀察DRG的神經(jīng)突起生長狀態(tài)。

1.2.5 雞胚DRG突起生長條件的優(yōu)化

將分離出來綜薦骨部的雞胚DRG置于含有RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)24 h后，接種于包被有Collagen fr o m rat tail的96孔板中，每孔1個DRG，每組5個復(fù)孔，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采取雙盲發(fā)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：（1）加入含有不同血清濃度的RPMI-1640培養(yǎng)液（1.0%，0.5%，0%）200μL／孔，實(shí) 驗(yàn)組加 入NGF使其終濃度為50 ng／ml，空白組加入等體積PBS，培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡下觀察DRG的神經(jīng)突起生長狀態(tài)，以確定適合的血清濃度；（2）分別用 RPMI-1640和DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入NGF使其終濃度為50 ng／mL，空白組加入等體積PBS，培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至120 h，于不同時間段，在倒置顯微鏡下進(jìn)行神經(jīng)突起生長狀態(tài)的觀察比較，以確定適合的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2 結(jié)果

如圖1所示。

2.1 雞胚DRG的摘取方法

圖1 雞胚DRG摘取方法步驟的細(xì)化Fig.1 The details of the steps of chicken embryo DRG dissecting method

2.2 雞胚DRG神經(jīng)突起生長的判定標(biāo)準(zhǔn)

神經(jīng)營養(yǎng)因子生物活性中突起生長的判定標(biāo)準(zhǔn)［5］：雞胚DRG無突起生長以“－”表示，見圖2；雞胚DRG突起少且短以“＋”表示，見圖3；雞胚DRG突起較多且較長以“＋＋”表示，見圖4；雞胚DRG突起多且長，出現(xiàn)樹根狀生長均以“＋＋＋”表示，見圖5；雞胚DRG突起密且長，出現(xiàn)樹根狀生長以“＋＋＋＋”表示，見圖6。

圖2 雞胚DRG無突起生長，記為“－”Fig.2 Chicken embryo DRG no neurite outgrowth，denoted by“－ ”

圖3 雞胚DRG突起少且短，記為“＋”Fig.3 Chicken embryo DRG neurites less and short，denoted by“＋”

圖4 雞胚DRG突起較多且較長，記為“＋＋”Fig.4 Chicken embryo DRG neurites more and longer，denoted by“＋ ＋”

圖5 雞胚DRG突起多且長，出現(xiàn)樹根狀生長，記為“＋＋＋”Fig.5 Chicken embryo DRG neurites more and longer，roots like growth，denoted by“＋ ＋ ＋”

2.3 雞胚DRG的鑒定

圖6 雞胚DRG突起密且長，出現(xiàn)樹根狀生長，記為“＋＋＋＋”Fig.6 Chicken embryo DRG neurites dense and long roots like growth，denoted by“＋ ＋ ＋ ＋”

取胸椎部、綜薦骨部、尾椎部雞胚DRG，置于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基分別進(jìn)行培養(yǎng)，于72 h觀察NGF組和空白組雞胚DRG突起生長狀態(tài)。結(jié)果（表1）顯示：胸椎部DRG對NGF的反應(yīng)性差，綜薦骨DRG部狀態(tài)均一，對NGF反應(yīng)最好，尾椎部DRG狀態(tài)不一且大多無突起生長。由此可知，綜薦骨部的DRG是最佳的實(shí)驗(yàn)取材部位。

表1 不同部位雞胚DRG神經(jīng)突起的生長狀態(tài)Tab.1 Different parts of the chicken embryo DRG neurite growth state

2.4 雞胚DRG突起生長條件的優(yōu)化

2.4.1 血清濃度的優(yōu)化

在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入不同濃度的FBS（1.0%，0.5%，0%），于72 h在倒置相差顯微鏡下觀察NGF組和空白組雞胚DRG神經(jīng)突起生長狀態(tài)。結(jié)果（表2）顯示：培養(yǎng)72 h后，100%RPMI-1640培養(yǎng)基組，NGF組和空白組有明顯差異，空白組雞胚DRG幾乎沒有神經(jīng)突起的生長；血清濃度為1.0%和0.5%組中，NGF組和空白組雖有差異，但是差異不明顯，且實(shí)驗(yàn)組和空白組的雞胚DRG均有大量的細(xì)胞遷出。由此可知，0%血清是最適血清濃度。

表2 不同血清濃度對雞胚DRG神經(jīng)突起生長的影響Tab.2 Effect of different serum concentration on the growth of chicken embryo DRG neurons

2.4.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

將雞胚DRG分別置于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于不同時間觀察NGF組和空白組雞胚DRG神經(jīng)突起的生長狀態(tài)（表3～4）。結(jié)果顯示：RPMI-1640培養(yǎng)基中，NGF組DRG在72 h狀態(tài)最好，神經(jīng)突起的生長最明顯，且120 h DRG狀態(tài)較好，空白組雞胚DRG幾乎未見無神經(jīng)突起的生長；DMEM培養(yǎng)基中，NGF組在120 h的時候，雞胚DRG有部分出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，樹根狀突起有斷開現(xiàn)象，狀態(tài)不如96 h，由此可知，RPMI-1640培養(yǎng)基比 DMEM 培養(yǎng)基更適雞胚DRG的生長。

表3 RPMI-1640培養(yǎng)基對雞胚DRG神經(jīng)突起生長的影響Tab.3 Effect of RPMI-1640 medium on the growth of chicken embryo DRG neurons

表4 DMEM培養(yǎng)基對雞胚DRG神經(jīng)突起生長的影響Tab.4 Effect of DMEM medium on the growth of chicken embryo DRG neurons

3 討論

不同部位雞胚DRG的生長狀態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)不同，傳統(tǒng)的摘取方法是整條脊柱夾去脊髓蓋，去除脊髓后逐個摘取DRG，但在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)該方法造成大量DRG的損失，應(yīng)根據(jù)不同部位DRG的解剖特點(diǎn)，分部摘取。DRG根據(jù)位置的不同可分為椎管內(nèi)型、椎間孔型、椎間孔外型3種［6］，雞的胸椎共有7塊，每個胸椎兩側(cè)連有一對肋骨，該部位的DRG大多為椎間孔型；綜薦骨是由最后1塊胸椎、6塊腰椎、2塊薦椎和約7塊尾椎愈合而成，該部位的DRG有椎間孔型和椎間孔外型，大部分是椎間孔外型，且椎間孔外型的DRG形態(tài)均一，體積較大，容易摘取，最適合實(shí)驗(yàn)；尾椎中，除與綜薦骨愈合的7塊外，還有5塊游離的尾椎，該部位的DRG為椎管內(nèi)型。而在解剖過程中，為了使視野清晰，往往會過分地清除脊柱兩側(cè)的骨骼與組織。此時，椎間孔外型的DRG會連同組織一起被摘除，造成極大的浪費(fèi)。本研究在實(shí)驗(yàn)探索中，將胸椎部與綜薦骨部和尾椎部的DRG用不同的方法分開摘?。▓D1），大大提高了DRG的摘取數(shù)量、質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)的可操作性，減少了因?yàn)檎∵^程造成的實(shí)驗(yàn)材料的浪費(fèi)。

同時，將所獲得的DRG隨機(jī)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件與時間下，DRG的狀態(tài)不均一的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)將胸椎部、綜薦骨部、尾椎部的DRG分開培養(yǎng)，并利用NGF對各部位DRG進(jìn)行鑒定，綜薦骨部的DRG狀態(tài)均一，對神經(jīng)營養(yǎng)因子敏感，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高；而胸椎部有少數(shù)的DRG對神經(jīng)營養(yǎng)因子不敏感；尾椎部DRG大多無神經(jīng)突起的生長或突起生長狀態(tài)不均一（表1）。在摘取過程中也發(fā)現(xiàn)，綜薦骨部的DRG形態(tài)均一，體積較大，摘取方便，為保證實(shí)驗(yàn)的均一性和可重復(fù)性，本實(shí)驗(yàn)選擇綜薦骨部的DRG做實(shí)驗(yàn)取材部位。

利用NGF對不同部位的DRG進(jìn)行鑒定的同時，對培養(yǎng)條件也進(jìn)行了優(yōu)化。首先是血清濃度的選擇，使用RPMI-1640作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入不同比例的FBS，F(xiàn)BS濃度為1.0%、0.5%時，空白組DRG也有較明顯的突起生長，空白組和NGF組雖有差異，但是這種差異假陽性率較高，因?yàn)檠逯写嬖诟鞣N因子，不能排除是血清中其他因子的影響還是神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用，并且在有血清的培養(yǎng)基中，出現(xiàn)DRG細(xì)胞大量的遷出的現(xiàn)象，究其原因，可能FBS有利于細(xì)胞初期的分裂而不利于神經(jīng)細(xì)胞的分化［7］；而無血清培養(yǎng)基組可以排除這種假陽性率，空白組和NGF組差異明顯，且細(xì)胞的遷出較少（表2）。由此可知，無血清培養(yǎng)基是較適合的培養(yǎng)基。

在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)對常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM進(jìn)行了對比，將綜薦骨部DRG分別置于這2種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并連續(xù)觀察120 h，由表3、表4可以看出24 h時DRG神經(jīng)突起的生長無明顯差異，較短且少，在72 h時，DRG神經(jīng)突起生長最明顯且生長趨于穩(wěn)定，出現(xiàn)樹根狀生長，120 h DRG的狀態(tài)開始變差，但RPMI-1640組DRG在120 h的狀態(tài)比DMEM組狀態(tài)好，DMEM組有部分DRG出現(xiàn)彌散和細(xì)胞遷出現(xiàn)象。

對兩種培養(yǎng)基的比較發(fā)現(xiàn)RPMI-1640中的氨基酸種類及某些維生素比DMEM多，如天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸、脯氨酸、維生素B12、生物素、HEPES等。氨基酸為細(xì)胞提供營養(yǎng)保證，使細(xì)胞既能維持活力，又能有效合成產(chǎn)物，氨基酸一旦缺失，其代謝產(chǎn)物的積聚對細(xì)胞的生長不利，可使細(xì)胞內(nèi)氨基己糖、半乳糖胺增加，影響細(xì)胞蛋白的糖基化［8－9］；維生素是維持細(xì)胞生長的餓生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成輔基或輔酶，對細(xì)胞代謝有重大影響；在 RPMI-1640中富含的HEPES是一種氫離子緩沖劑［10－11］，可較長時間穩(wěn)定培養(yǎng)液中的p H值；有利于減緩細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的大量乳酸［12］，使培養(yǎng)液p H下降，抑制細(xì)胞生長的缺陷。由此可知，RPMI-1640培養(yǎng)基是較適合的培養(yǎng)基，72 h是觀察神經(jīng)突起生長最合適時間。

綜上所述，在雞胚DRG神經(jīng)突起鑒定實(shí)驗(yàn)中，取綜薦骨部的DRG，饑餓培養(yǎng)24 h后，接種于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，NGF作為陽性對照，PBS作為陰性對照，并于72 h進(jìn)行觀察，為較適合的實(shí)驗(yàn)條件。本研究的雞胚DRG的摘取方法和鑒定方法為神經(jīng)營養(yǎng)因子突起鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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The Improvement and Opti mization of the Method of Dissecting Chicken Embryo Dorsal Root Ganglion and its Culture Conditions

SHAN Liya，ZHANG Yunhua，ZHU Meiyi，ZHU Jingling，WANG Haiyan，HUANG Jin
（Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Disease of Ministry of Education／Depart ment of Biochemistr y，School of Medicine／，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

Objective：To study the effective method of dissecting chicken embryo DRG and optimize its culture conditions so as to lay a f oundation f or neurotrophic factor neurite outgr owth identification.Method：Accor ding to the growth status and anato mical features of chicken embryo DRG，by separate dissecting method，we dissected chicken embryo DRG，and identified different parts of DRG with NGF；at the same ti me，by analyzing the effect of different concentration of ser u m，different mediu m and different observation ti me on the neurite outgrowth of chicken embr yo DRG，we opti mized the culture conditions.Result：Dissecting chicken embryo DRG with separate dissecting method improves the maneuverability and repeatability of the experi ment；the opti mu m material of chicken embr yo DRG for experi ment is t he part of synsacr u m；the opti mu m mediu m for neurite outgr owth identification is serum-free RPMI-1640 medium.

dorsal root ganglia of chicken embr yo；neurotrophin；biological activity

R741

A

1007-7383（2013）05-0612-06

2013-03-06

石河子大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（ZRKX2010ZD03）

單莉婭（1986-），女，碩士生，專業(yè)方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)功能與疾病，e-mail：sly＿119＠163.com。

黃瑾（1963-），女，教授，從事蛋白因子的功能與機(jī)制研究，e-mail：huangjin623＠163.co m。