王 紅

(鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校，河南 鄭州 450011)

心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是造成心力衰竭(heart failure，HF)的主要原因。運動康復(fù)療法可改善HF 患者臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、降低死亡率［1］，但其具體分子機制尚不明了。AMP 激活的蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)可通過調(diào)節(jié)下游的靶分子如乙酰輔酶A 羧化酶(acetyl coenzyme a carboxylase，ACC)［2］、葡 萄 糖 轉(zhuǎn) 運 體4(glucose transport－4，GLUT4)［3］等進而調(diào)控能量代謝，在心臟的生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，一次急性運動可上調(diào)正常心臟AMPK 表達［4］，但長期有氧運動對HF 心臟AMPK 表達的影響尚無報道。本研究以MI 后HF 大鼠為模型，觀察長期有氧運動對心臟結(jié)構(gòu)和功能、AMPK 及其下游的靶分子ACC和GLUT4 蛋白表達的影響，探討運動防治心衰的分子機制，為HF 患者最佳運動康復(fù)處方的制定提供依據(jù)。

1 實驗資料

1.1 動物建模、分組及訓練方案

雄性Wistar 大鼠45 只，體重250 ～280g，10 周齡。隨機分為心梗組(30 只)和假手術(shù)組(Sham，15 只)，心梗組大鼠麻醉后，行氣管插管，連接動物呼吸機，監(jiān)測心電圖。于胸骨左側(cè)第3 肋與第4 肋之間開胸，由左心耳下方2 ～3 mm 處用0 號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支。QRS 波增高增寬，sT 段弓背上抬0.2 mV 以上持續(xù)30 min 為結(jié)扎成功。迅速放回心臟，關(guān)閉胸腔，縫合胸壁。假手術(shù)組只栓線，不結(jié)扎，其他操作同心梗組。大鼠休息4 周后，心梗阻再隨機分為心梗安靜組(MI)和心梗運動組(MI+E)，各15 只。MI+E 組進行為期10 周的跑臺有氧運動，訓練模式為5°，10 m/min(相當于45%VO2max，即有氧運動)。

1.2 血流動力學參數(shù)測定［5］

腹膜麻醉后，仰臥固定，游離右側(cè)頸總動脈，插入充滿1%肝素生理鹽水導(dǎo)管(PE－50)至左心室，連接壓力換能器后，輸入Medlab 生物信號采集處理系統(tǒng)，穩(wěn)定20 min，記錄左心室收縮期壓力(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end－diastolic pressure，LVEDP)、左心室壓力最大上升速率(maximal developing rate of left ventricular pressure，+dp/dtmax)和左室壓力最大下降速率(maximal descending rate of left ventricular pressure，－dp/dtmax)。

1.3 心肌細胞膜的分離

按照王東等［6］的方法以差速離心法分離心肌細胞膜。將心肌細胞用PBS 沖洗后，加入1 ml 裂解液，勻漿40 次，4℃700 g 離心10 min，取上清，4℃14000 rpm 離心30 min，取沉淀加入1 ml 抽提buffer，混勻后4℃靜置15 min，再以3000 rpm 離心5 min，37℃水浴5 min，室溫13000 rpm 離心5 min，取下層液體，加入500 μL 雙蒸水，4℃靜置5 min，下層液體即為心肌細胞膜提取物，－80℃保存待測肌膜GLUT4 蛋白表達水平。

1.4 Western blot 測 定 心 肌 總AMPKα、磷 酸 化AMPKα(p－AMPKα)、總ACC、磷酸化ACC(p－ACC)、總GLUT4 和肌膜GLUT4 蛋白表達水平

分別提取心肌細胞總蛋白和心肌細胞膜總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠，恒壓120 V、80 mA 預(yù)電泳10 min，上樣，進行SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，兔抗大鼠AMPKα、p－AMPKα、ACC、p－ACC 和GLUT4 多克隆抗體于4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌PVDF 膜。加二抗后室溫孵育1 h，暗室中滴加發(fā)光底物混合物2 mL 于PVDF 膜上，曝光、顯影、定影。對目的蛋白進行光密度分析，以β－actin 為內(nèi)參。目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/β－actin蛋白灰度值。

1.5 心肌組織學觀察

心室肌組織常規(guī)固定脫水后，從結(jié)扎線下垂直于心臟長軸橫切左心室，取心尖部分石蠟包埋，自心底部向心尖部連續(xù)切取厚4 μm 的標本，Masson 染色。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，使用單因素方差分析進行統(tǒng)計學檢驗，各組兩兩比較使用Bonferroni 檢驗。顯著性水平定為P ＜0.05，非常顯著水平定為P ＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學參數(shù)變化

表1 大鼠血流動力學參數(shù)變化

實驗結(jié)束后，與Sham 組比較，MI 組LVEDP 升高(P＜0.01)，LVSP 和±dp/dtmax 顯著性降低(均為P ＜0.01)，表明MI 大鼠出現(xiàn)了心室收縮和舒張功能的下降。與MI 組比較，MI+E 組LVSP 和+dp/dtmax顯著性升高(均為P ＜0.01)，而LVEDP 則顯著性降低，提示10 周有氧運動改善了MI 后HF 大鼠的心功能。(見表1)

2.2 心肌組織學變化

Masson 染色示膠原纖維呈淺藍色，心肌纖維呈紅色。Sham 組心肌細胞著色均勻，無明顯膠原成分。MI組心肌纖維化程度明顯，只有少量心肌細胞。MI+E 組較MI 組心肌細胞增多，膠原纖維顯著減少(見圖1)。

圖1 各組心肌組織學變化

2.2 蛋白表達的變化

與Sham 組比較，MI 組總AMPKα(P ＜0.01)、p－AMPKα(P ＜0.05)、總ACC(P ＜0.01)、p－ACC(P ＜0.01)、總GLUT4(P ＜0.01)和肌膜GLUT4(P ＜0.05)蛋白水平均顯著性下降，但p－AMPKα/總AMPKα、p－ACC/總ACC、肌膜GLUT4/總GLUT4 比值則均顯著性升高(均為P ＜0.01)。與MI 組比較，MI+E 組總AMPKα(P ＜0.01)、p－AMPKα(P ＜0.01)、總ACC(P ＜0.01)、p－ACC(P ＜0.01)、總GLUT4(P ＜0.05)和肌膜GLUT4(P ＜0.01)蛋白水平以及p－AMPKα/總AMPKα(P ＜0.01)、p－ACC/總ACC(P ＜0.01)、肌膜GLUT4/總GLUT4(P ＜0.01)比值均顯著性升高(見圖2)。

圖2 心肌各蛋白水平的變化

3 討論

本研究的發(fā)現(xiàn)是，長期有氧運動在改善MI 后HF大鼠心臟功能的同時，促進AMPK 及其下游靶分子ACC 表達上調(diào)和GLUT4 向肌膜轉(zhuǎn)位，提示AMPK 在HF 運動康復(fù)中起關(guān)鍵作用。

AMPK 是一種異源三聚體(αβγ)蛋白激酶，其中α 為催化亞基，βγ 為調(diào)節(jié)亞基。它是細胞能量代謝變化的感受器(即感受胞漿內(nèi)AMP/ATP 的變化)，在機體能量代謝過程中起著中心調(diào)控作用［7］。AMPK 可磷酸化ACC 使其失活［2］，減少丙二酸單酰輔酶A 合成，解除了對脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)進入線粒體的限速酶——肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶－1(CPT－1)的抑制作用［8］，增加FA 氧化［3］;通過增加GLUT4 向肌膜轉(zhuǎn)位而促進葡萄糖攝取并增強糖酵解作用［9］。

大量證據(jù)顯示，AMPK 在心臟的正常發(fā)育以及心肌代謝過程中起重要作用，同時對心肌缺血－再灌注損傷起保護作用［10，11］。活化AMPK 可抑制病理性心肌肥大［12］，AMPK 缺失后在壓力過負荷下更易造成病理性心臟肥大和HF［13］。Tian 等［14］通過結(jié)扎大鼠腹主動脈建立壓力過負荷HF 模型發(fā)現(xiàn)，術(shù)后17 周心肌p－AMPKα 活性顯著增加，這與本研究結(jié)果一致，即MI 組p－AMPKα/AMPKα 較Sham 組有所增加?？梢?，當心臟應(yīng)激(特別是心肌缺血)、有氧代謝受到破壞時，AMPK 代償性升高可保證心肌能量的產(chǎn)生并對心肌損傷起保護作用。但AMPK 在HF 時的這種代償能力有限，雖然可使心肌ACC 和肌膜GLUT4 相對含量升高［14］，但由于各蛋白總量均顯著降低，因此無法滿足HF 時心肌的能量供應(yīng)，心功能(血流動力學參數(shù))不可避免的進一步下降。

正常心臟的主要供能物質(zhì)是FA，可產(chǎn)生60 ～70%ATP，其余大約30%ATP 由葡萄糖代謝供給。HF時心臟能量代謝特點是FFA 氧化減少、葡萄糖酵解增加，即代謝性重塑。這是心臟保護機制，即消耗單位氧分子可產(chǎn)生更多的ATP［15］，但乳酸和脂質(zhì)堆積造成心臟毒性又加重的HF 的進程。運動可改善心肌能量代謝，但機制未明。研究證實，運動是影響AMPK 活性的主要因素之一。運動時AMP/ATP 比值升高并上調(diào)心肌p－AMPK 表達［4］，因此一次急性運動可活化AMPK［16］，并呈現(xiàn)運動強度依賴性，長期運動則可提高骨骼肌、脂肪與肝臟AMPK 活性［17，18］，提示AMPK 在調(diào)節(jié)能量底物代謝以及對運動適應(yīng)中起重要作用。但長期運動訓練對病理心臟AMPK 表達的影響尚無報道。在本研究中，經(jīng)過10 周運動訓練，MI+E 組較MI組心功能(血流動力學參數(shù))改善，p－AMPKα 顯著升高，同時其下游的靶蛋白ACC 活性(即p－ACC)升高，ACC 通過增強CPT－1 的活性促進FA 氧化;肌膜GLUT4 含量升高，提示運動誘導(dǎo)的AMPK 增加促進GLUT4 向肌膜轉(zhuǎn)位，葡萄糖攝取增加。上述結(jié)果說明，長期訓練可持續(xù)上調(diào)AMPK 表達水平，F(xiàn)A 氧化、葡萄糖利用均增加，同時提示，AMPK 在運動改善MI后HF 大鼠代謝性重塑中扮演重要角色。

4 結(jié)論與建議

長期有氧運動通過上調(diào)AMPK 表達改善了MI 后HF 大鼠的心功能。今后的研究應(yīng)深入探討HF 運動康復(fù)中AMPK 介導(dǎo)的信號通路的作用，進一步揭示運動防治心衰的分子機理，以期為HF 患者制定最佳運動康復(fù)處方提供理論依據(jù)。

［1］Keteyian SJ.Exercise training in congestive heart failure:risks and benefits［J］.Prog Cardiovasc Dis，2011，53(6):419－28.

［2］Dyck JR，Kudo N，Barr AJ，et al.Phosphorylation control of cardiac acetyl－CoA carboxylase by cAMP－dependent protein kinase and 5＇－AMP activated protein kinase［J］.Eur J Biochem，1999，262(1):184－90.

［3］Steinberg GR.Role of the AMP－activated protein kinase in regulating fatty acid metabolism during exercise［J］.Appl Physiol Nutr Metab，2009，34(3):315－22.

［4］Coven DL，Hu X，Cong L，et al.Physiological role of AMPactivated protein kinase in the heart:graded activation during exercise［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，285(3):629－36.

［5］王翔，洪峰，魏源.三種強度長期訓練對大鼠心肌力學的影響［J］.首都體育學院學報，2002，14(2):70－71，74.

［6］王東，周麗諾，張偉偉，等.PI3－K 對自發(fā)性糖尿病大鼠心肌細胞膜GLUT4 含量的影響［J］.皖南醫(yī)學院學報，2008，27(6):395－398.

［7］Kemp BE，Mitchelhill KI，Stapleton D，et al.Dealing with energy demand:the AMP－activated protein kinase［J］.Trends Biochem Sci，1999，24(1):22－5.

［8］謝謹，龔豪杰，張纓.耐力訓練對AMPKα2 基因敲除小鼠骨骼肌CPT－1 表達的影響［J］.天津體育學院學報，2010，25(1):30－32.

［9］3rd RRR，Bergeron R，Shulman GI，et al.Translocation of myocardial GLUT －4 and increased glucose uptake through activation of AMPK by AICAR［J］.Am J Physiol，1999，277(22):643－9.

［10］Lopaschuk GD.AMP－activated protein kinase control of energy metabolism in the ischemic heart［J］.Int J Obes(Lond)，2008，32 Suppl 4:29－35.

［11］Kim AS，Miller EJ，Young LH.AMP－activated protein kinase:a core signalling pathway in the heart［J］.Acta Physiol(Oxf)，2009，196(1):37－53.

［12］Li HL，Yin R，Chen D，et al.Long－term activation of adenosine monophosphate －activated protein kinase attenuates pressure－overload－induced cardiac hypertrophy［J］.J Cell Biochem，2007，100(5):1086－99.

［13］Zamilpa R，Lindsey ML.AMP activated protein kinase 2 protection during hypertension－induced hypertrophy:a common mediator in the signaling crossroads［J］.Hypertension，2008，52(5):813－5.

［14］Tian R，Musi N，D＇Agostino J，et al.Increased adenosine monophosphate－activated protein kinase activity in rat hearts with pressure－overload hypertrophy［J］.Circulation，2001，104(14):1664－9.

［15］van BM，van NFA，der Vusse GJ v.Metabolic remodelling of the failing heart:beneficial or detrimental?［J］.Cardiovasc Res，2009，81(3):420－8.

［16］Musi N，Hirshman MF，Arad M，et al.Functional role of AMP－activated protein kinase in the heart during exercise［J］.FEBS Lett，2005，579(10):2045－50.

［17］Langfort J，Viese M，Ploug T，et al.Time course of GLUT4 and AMPK protein expression in human skeletal muscle during one month of physical training［J］.Scand J Med Sci Sports，2003，13(3):169－74.

［18］Takekoshi K，F(xiàn)ukuhara M，Quin Z，et al.Long－term exercise stimulates adenosine monophosphate－activated protein kinase activity and subunit expression in rat visceral adipose tissue and liver［J］.Metabolism，2006，55(8):1122－8.