武警陜西省總隊醫(yī)院胃腸外科（西安710054） 盧 翔 段 煒 張 力 李會文 李向陽 王周勤

急性壞死性胰腺炎（Acute necrotizing pancreatitis，ANP）腸道粘膜損傷的本質(zhì)是由一系列炎癥因子或介質(zhì)介導的過度炎癥反應和炎癥損傷，可繼發(fā)腸道屏障功能衰竭，腸腔內(nèi)細菌及毒素移位，并進一步激發(fā)全身炎癥反應綜合征（Systemic inflammatory response syndrome，SIRS），腸道作為SIRS的原動力，ANP發(fā)生后NF－κB可活化并產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，加劇腸道粘膜的損傷［1，2］，這些促炎性細胞因子、趨化因子、粘附因子等基因的活化和表達表明核因子κB（NF－κB）的活化可能是其中的關鍵因素；有報道生長激素（Growth hormone，GH）具有維護ANP腸粘膜屏障功能，促進腸上皮修復，減少腸道細菌和毒素移位作用［3］。本實驗通過觀察ANP腸粘膜絨毛細胞（IMN）中 NF－κB的 表達 情 況，初步探討GH對ANP腸粘膜NF－κB活化及其介導炎癥介質(zhì)表達的影響。

材料與方法

1 實驗分組及急性壞死性胰腺炎（ANP）模型制備健康成年雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量250～300g，購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心。以數(shù)字表法將動物隨 機 分 成 三組：正常對照組、ANP組及GH處理組（處理組）。ANP模型制備：大鼠術前禁食12h，不禁水。20% 烏拉坦溶液（0．5ml／kg）腹腔注射麻醉，正中切口入腹，于肝十二指腸韌帶近肝門側用小動脈夾暫時夾閉胰膽管，由十二指腸前壁進針，進入胰膽管內(nèi)，夾閉胰膽管出口，以0．1ml／min勻速逆行注入5% ?；悄懰徕c（1ml／kg），10min后去除動脈夾，關腹。處理組在ANP模型制成前30min經(jīng)尾靜脈注射GH（0．75U／kg）。正常對照組自胰膽管內(nèi)逆行注入等量生理鹽水。

2 觀察指標及實驗方法

2．1 取材：末段回腸粘膜絨毛灌洗、細胞留取及各組動物手術后6h處死，然后取材。所有標本均重復檢查2次。在動物處死后行末端回腸灌 洗，收 集 灌 洗液（TILF）。留取少量灌洗液，用于測定腫瘤壞死 因 子 －α（TNF－α）、白 細 胞 介 素1β（IL－1β）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、細胞間粘附分子（ICAM－1）和單核細胞趨化蛋白（MCP－1）。將 剩余灌洗液離心獲取細胞沉淀，備用。大鼠末端回腸用于組織學檢查。

2．2 病理形態(tài)學檢查：將各組大鼠的末端回腸置10% 甲醛溶液中浸泡，石蠟包埋，行蘇木精 －伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察回腸組織學改變。

2．3 BALF中腫 瘤 壞 死 因 子 －α（TNF－α）、白細 胞 介 素1β（IL－1β）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、細胞間粘附分子（ICAM－1）和單核細胞趨化蛋白（MCP－1）測定：應用 BioSoure公 司 的 TNF－ α、IL－1β、iNOS、ICAM－1和MCP－1酶 聯(lián) 免 疫 吸 附法（ELISA）試劑盒測定，嚴格按照說明書操作。

2．4 Western blot檢 測 NF－κB含 量：應用北京普利萊公司胞核 －胞漿蛋白制備試劑盒提取腸粘膜組織核蛋白并測定濃度后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果行計算機掃描，用圖像分析系統(tǒng)，測 定 目 的 條 帶 與內(nèi) 參 的 光 密 度 值（OD）。并取兩者的比值作半定量分析。

3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準差表示。數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，相關性采用線性分析，應用SPSS13．0分析軟件分別對各組的均數(shù)行統(tǒng) 計學處理。P＜0．05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 腸粘膜組織大體變化及病理組織學所見：對照組大鼠腸粘膜呈粉紅色，表面光滑，無滲出及出血；光學顯微鏡下見腸粘膜絨毛組織結構清晰，腸粘膜細胞壁薄，腸粘膜內(nèi)未見滲出液。ANP組肉眼見整個腸粘膜充血，間有斑片狀壞死，鏡下見腸粘膜間質(zhì)水腫，彌漫性出血，腸粘膜細胞結構紊亂，血管擴張淤血，有大 量 炎性細胞浸潤，腸粘膜內(nèi)有炎性滲出。GH處理組上述變化較ANP組明顯減輕（圖1）。

圖1 各組腸粘膜組織病理切片（HE×200） A：ANP組；B：對照組；C：GH處理組（圖片A、C中，箭頭所指為細胞病理改變）

2 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和MCP－1含量的變化：正 常 大 鼠腸粘膜組織中TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 較 低，處 理 組 與正常對照組相比，各指標差異均無統(tǒng)計學意義；ANP組各項指標均高于正常對照組和處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0．05），見表1。

表1 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 （±s）

表1 腸粘膜組織中 TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1含量 （±s）

注：＊與對照組比較P＜0．05；△與ANP組比較P＜0．05

組 別 TNF－α（pg／ml） IL－β（pg／ml） iNOS（pg／ml） ICAM－1（pg／ml） MCP－1（pg／ml）對照組 6．34±0．64 4．08±1．92 0．08±0．03 0．26±0．04 0．13±0．01 ANP組 8．71±0．89＊ 33．05±11．20＊ 0．17±0．02＊ 0．75±0．21＊ 0．20±0．05＊GH組 7．44±0．58△ 10．15±3．68△ 0．07±0．04△ 0．58±0．15△ 0．16±0．06△

3 各組腸粘膜絨毛核蛋白中NF－κB P65活性：NF－κB P65在 對 照 組 的腸粘膜絨毛核 蛋 白 中 表 達程度最低，在ANP組中呈高表達，在GH處理組呈中度表達（圖2），見表2。

4 相關性分析：在ANP組，腸粘膜組織中NF－κB P65的表達呈高度相關（r＝－0．706，P ＝0．015）；在 GH處理組，腸粘膜組織中NF－κB P65的表達呈中度相關（r＝－0．572，P ＝0．019）。

圖2 各組腸粘膜絨毛核蛋白中的NF－κB表達

表2 腸粘膜組織核蛋白中NF－κB P65／β－actin相對量（±s）

表2 腸粘膜組織核蛋白中NF－κB P65／β－actin相對量（±s）

注：＊與對照組比較P＜0．05；△與ANP組比較P＜0．05

組 別 NF－κB P65／β－actin對照組0．08±0．03 ANP組 0．18±0．06＊GH組 0．11±0．04△

討 論

急性壞死性胰腺炎可激發(fā)全身炎癥反應綜合征的發(fā)生，腸道受缺血、缺氧等因素的刺激，在腸粘膜絨毛細胞合成大量細胞因子等炎癥介質(zhì)，一方面加重腸道屏障功能的損害、衰竭，另一方面則促使全身炎癥反應不斷擴大［4］。目前有研究報道，核因子－κB（Nuclear factorκB，NF－κB）是調(diào)控多種炎性因子基因表達的樞紐，是一重要的細胞內(nèi)信號傳導物質(zhì)，活化后啟動細胞核內(nèi)相應的細胞因子、粘附分子和趨化因子的啟動子，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應［5］。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，ANP組IMN中NF－κB表達活性明顯高于正常對照組及處理組；TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1的 表 達 較 正 常 對 照 組及處理組明顯升高。提示在ANP時有NF－κB的大量激活，導致多種炎癥介質(zhì)的過量釋放，使炎癥反應持續(xù)加重，進一步加重腸粘膜損傷。近來發(fā)現(xiàn)生長激素（GH）具有維護ANP腸粘膜屏障功能，促進腸上皮修復，減少腸道細菌和毒素易位的作用。提示GH可防止腸上皮細胞過度凋亡，下調(diào)炎癥介質(zhì)的釋放，具有抗炎效應［6］。GH具有促進蛋白質(zhì)合成，促進燒傷、創(chuàng)傷、感染等患者正氮平衡的恢復和創(chuàng)面組織生長，同時還可維持腸粘膜正常結構，促進腸粘膜功能的恢復［7］；本研究觀察發(fā)現(xiàn)GH下調(diào)它們的表達，提示GH可能通過降低TNF－α、IL－β、iNOS、ICAM－1和 MCP－1的表達影響局部白細胞浸潤，從而減輕腸粘膜屏障的炎性損傷。

核轉錄因子NF－κB是由可誘導的3個亞基組成的復合物，3個亞基分別為轉錄因子二聚體（P50和P65）和抑制亞基Ⅰ－κB。NF－κB由于ⅠκB的抑制作用主要以非活性形態(tài)存在于細胞質(zhì)。轉錄因子NF－κB在許多領域受到研究者的關注基于以下的幾點：罕見和快速的調(diào)節(jié)性，控制的基因范圍廣，在免疫過程處于中樞的角色，亞基的復雜性和牽涉若干個疾病。控制NF－κB的基本水平是通過與抑制蛋白ⅠκB的相互作用。最近的證據(jù)證實了不同機制調(diào)節(jié) NF－κB的IκB多樣形態(tài)存在。NF－κB可以被脂肪酶、脂多糖或者炎癥細胞因子激活例如TN F、IL－1、病毒感染、某一個病毒基因產(chǎn)物的表達、紫外線照射、B或T細胞活化、其他生理學的和非生理學的刺激物。NF－κB激活轉移至細胞核是通過ⅠκB定向磷酸化、降解，與NF－κB解離進行的。NF－κB一旦轉入細胞核即結合同族DN A序列和激活特異靶基因轉錄，大多數(shù)是編碼免疫和炎癥的重要蛋白。NF－κB／Rel因子控制大范圍的基因表達，例如編碼免疫球蛋白、細胞因子、化學增活素、干擾素、主要組織相容性復合物蛋白質(zhì)、生長因子、細胞粘附分子。NF－κB可與許多基因的啟動子結合，包括炎癥應答例如ICAM－1、E－選擇蛋白、VCAM、TNF－α、IL－1、IL－2、IL－6、IL－8、COX2 和iNOS［8～13］。因此，核轉錄因子NF－κB是炎癥反應的關鍵角色。本研究用P65單抗結合伊紅復染細胞漿檢測大鼠腸粘膜細胞核內(nèi)P65亞單位，正常狀態(tài)P50／P65復合體只存在于細胞漿，因此該方法可以觀察NF－κB的活化情況。結果觀察發(fā)現(xiàn)對照組腸粘膜陽性細胞數(shù)很少，而ANP組可發(fā)現(xiàn)大量NF－κB P65陽性細胞數(shù)；說明在ANP早期腸粘膜NF－κB就大量活化，介導了炎癥反應的擴大。NF－κB P65陽性細胞主要為腸絨毛頂端的上皮細胞及其下面的單核細胞，可能因為腸絨毛頂端作為接觸毒素的最前沿，因而該處的炎癥反應也最強烈。

本研究發(fā)現(xiàn)GH處理組NF－κB P65陽性細胞較ANP組明顯減少，說明GH有抑制NF－κB活化作用。結合GH能顯著下調(diào)ANP腸組織NF－κB介導的細胞因子表達，從而進一步揭示NF－κB及其介導的細胞因子表達參與了ANP腸道粘膜的損傷的發(fā)生。GH對ANP腸道的保護作用與GH下調(diào)腸粘膜細胞因子表達、抑制NF－κB活化有關。

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