陜西省榆林市第二醫(yī)院（榆林719000） 高不為

糖皮質(zhì)激素是一種在臨床上應(yīng)用廣泛的激素，可廣泛用于炎癥、風(fēng)濕及器官移植后產(chǎn)生的排斥反應(yīng)［1，2］。但大劑量長期使用糖皮質(zhì)激素，會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)。特別是對(duì)骨骼產(chǎn)生的影響，最嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松，導(dǎo)致發(fā)生病理性骨折的危險(xiǎn)大增［3］。目前研究骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制已經(jīng)深入到細(xì)胞和分子水平，仍然有很多問題需繼續(xù)深入研究。實(shí)驗(yàn)證明不同劑量的地塞米松在體外對(duì)骨骼產(chǎn)生的影響不同［4］。門冬氨酸特異半胱氨酸蛋白酶（Caspases）存在于胞質(zhì)溶膠中，是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)半胱氨酸蛋白酶，對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程有非常重要的作用。Caspase－3是Caspase家族成員中研究最多的一種半胱氨酸蛋白酶，功能相對(duì)明確，其活化的程度反映了凋亡發(fā)生的強(qiáng)弱［5，6］。本組觀察應(yīng)用不同劑量地塞米松對(duì)大鼠骨生物指標(biāo)、成骨細(xì)胞調(diào)亡及Caspase－3表達(dá)產(chǎn)生的影響，初步探討地塞米松對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨代謝的影響機(jī)制，從而為提出相關(guān)預(yù)防措施提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 動(dòng)物與分組 將3月齡的雌性SD大鼠40只隨機(jī)分為四組：對(duì)照組（10只），地塞米松（美國內(nèi)布拉斯加大學(xué)藥學(xué)院）低劑量組（1mg／kg，10只），地塞米松中劑量組（2．5mg／kg，10只），地塞米松高劑量組（5 mg／kg，10只），尾靜脈注射，2次／周。連續(xù)給藥8周，在動(dòng)物處死前前3天或者前4天頸部皮下注射鈣黃綠素（美國Sigma公司）進(jìn)行體內(nèi)雙熒光標(biāo)記。飼養(yǎng)室溫24～28℃，濕度50%～60%，分籠飼養(yǎng)。

2 骨生物指標(biāo)測定 取四組大鼠的第5腰椎（L5）與第3腰椎（L3），剔除周圍組織與肌肉，生理鹽水沖洗后用錫紙包裹，裝代－20℃凍存，L3進(jìn)行骨礦含量測定；L5剪去腰椎椎弓打磨后，進(jìn)行壓縮力學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測最大載荷值。

3 成骨細(xì)胞培養(yǎng) 四組大鼠引頸法處死后，75%酒精浸泡消毒10min。將腰椎骨剪成大小約1mm2的小塊，加入0．25%胰蛋白酶消化約15min；終止消化3d后換液，7～10d后待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%后再傳代培養(yǎng)。

4 細(xì)胞凋亡檢測與Caspase－3活性檢測 將成骨細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中放置有無菌蓋玻片，使細(xì)胞貼壁生長，分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，分別于24h、48h、72h每組隨機(jī)選取3個(gè)樣本，進(jìn)行熒光染色，以紫外光340nm波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)；每個(gè)樣本隨機(jī)選取三個(gè)視野計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，算出凋亡率（凋亡率＝凋亡細(xì)胞／細(xì)胞總數(shù)X100%），樣本凋亡率取三個(gè)視野凋亡率的平均值。同時(shí)用Caspase－3分光光度法檢測試劑盒檢測 Caspase－3活性。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以SPSS18．0軟件分析，骨生物指標(biāo)以及成骨細(xì)胞調(diào)亡及Caspase－3表達(dá)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對(duì)比 見表1。隨著地塞米松濃度的增加，骨礦含量逐漸降低，但組間無顯著性差異（P＞0．05），而地塞米松低劑量組的最大壓縮載荷明顯少于其他三組（P＜0．05）。

2 凋亡率對(duì)比 見表2。經(jīng)過觀察，與對(duì)照組對(duì)比，地塞米松三組成骨細(xì)胞的凋亡率均明顯增加（P＜0．05），低劑量組的凋亡率少于中劑量組與高劑量組（P＜0．05）。

3 不同組別成骨細(xì)胞Caspase－3活性對(duì)比 見表3。與對(duì)照組對(duì)比，地塞米松三組成骨細(xì)胞的Caspase－3活性均明顯增加（P＜0．05），低劑量組的Caspase－3活性少于中劑量組與高劑量組（P＜0．05）。

表1 不同組別的腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對(duì)比（±s）

表1 不同組別的腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷的對(duì)比（±s）

組 別 骨礦含量（g） 最大壓縮載荷（N）對(duì)照組 0．12±0．01 214±30地塞米松低劑量組 0．11±0．02 179±51中劑量組 0．09±0．02 204±21高劑量組 0．08±0．03 209±53 F 值 0．962 3．621 P 值 0．088 0．018

表2 不同組別對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率的影響（%，±s）

表2 不同組別對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率的影響（%，±s）

組 別不同處理時(shí)間的凋亡率24h 48h 72h對(duì)照組 0．78±0．12 0．79±0．12 0．79±0．12低劑量組 1．75±0．84 2．27±1．13 2．39±1．32中劑量組 2．00±0．20 6．75±0．25 7．08±0．56高劑量組 2．88±0．20 7．27±1．13 7．39±0．52 F 值 12．658 18．965 14．328 P 值 0．000 0．000 0．000

表3 不同組別對(duì)成骨細(xì)胞Caspase－3活性的影響（±s）

表3 不同組別對(duì)成骨細(xì)胞Caspase－3活性的影響（±s）

組 別不同處理時(shí)間的Caspase－3活性24h 48h 72h對(duì)照組 0．09±．01 0．09±0．01 0．10±0．01低劑量組 0．12±0．02 0．20±0．01 0．18±0．01中劑量組 0．16±0．03 0．26±0．06 0．27±0．01高劑量組 0．19±0．03 0．29±0．02 0．30±0．02 F 值 6．215 10．009 12．526 P 值 0．003 0．000 0．000

討 論

當(dāng)前雖然在臨床上地塞米松的使用越來越多，但是對(duì)于骨質(zhì)疏松的影響也越來越大。近年的研究發(fā)現(xiàn)，使用地塞米松4周的小鼠成骨細(xì)胞凋亡增加3倍，28%的皮質(zhì)骨干骺端骨細(xì)胞凋亡［7］。另外地塞米松性骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞凋亡均有增加［8］。另外還有學(xué)者證實(shí)了地塞米松能夠誘導(dǎo)原代分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且這種效應(yīng)呈藥物濃度和時(shí)間依賴性［9］。

我們知道，骨質(zhì)量的好壞決定于骨量的多少、骨組織的功能這兩個(gè)方面的合理構(gòu)成，腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷能較好地反映骨骼的內(nèi)在力學(xué)性能。因此，能直觀觀察并定量分析腰椎骨礦含量與最大壓縮載荷，再結(jié)合反應(yīng)骨強(qiáng)度的生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋玫胤治龊驮u(píng)價(jià)骨質(zhì)量的狀態(tài)［10］。本組結(jié)果顯示：隨著地塞米松濃度的增加，骨礦含量逐漸降低，而地塞米松低劑量組的最大壓縮載荷明顯少于其他三組。說明不同劑量的地塞米松顯著抑制骨形成，并且有劑量依賴性。雖然腰椎骨量不減，骨力學(xué)性能改變不大。

骨骼生長、更新和修復(fù)過程包括成骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨形成過程以及破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨吸收過程［11］。正常情況下，骨骼系統(tǒng)中骨形成和骨吸收之間處于動(dòng)態(tài)平衡，許多疾病的發(fā)生，就是由于失去了這種動(dòng)態(tài)平衡，而出現(xiàn)骨吸收速度超過骨形成速度所致，導(dǎo)致骨細(xì)胞數(shù)量減少［12，13］。證實(shí)激素的作用主要是誘發(fā)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，骨組織生成減少，更新率降低，凋亡持續(xù)發(fā)展，引起股骨頭壞死。本組觀察到地塞米松三種劑量組成骨細(xì)胞的凋亡率均明顯增加，低劑量組的凋亡率少于中劑量組與高劑量組，證實(shí)了地塞米松能夠誘導(dǎo)原代分離培養(yǎng)的成骨樣細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且這種效應(yīng)呈藥物濃度和時(shí)間依賴性。同時(shí)本研究也觀察到地塞米松三組成骨細(xì)胞的Caspase－3活性均明顯增加，低劑量組的Caspase－3活性少于中劑量組與高劑量組。說明地塞米松可以通過激活Caspase－3而引起成骨細(xì)胞的凋亡，即Caspase－3在地塞米松誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。

總之，地塞米松的應(yīng)用能降低骨生物學(xué)質(zhì)量，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，Caspase－激活是一條主要途徑，而小劑量的應(yīng)用對(duì)于這種影響比較小。

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