摘要：以BamH Ⅰ和Sal Ⅰ 雙酶切pMD18-T-CmSS1和表達載體pBI121，再用T4 DNA連接酶將回收的目的片段反向與pBI121連接。結果證明，CmSS1反向插入到 pBI121 中， 得到了 pBI121-CmSS1的重組質粒；利用農桿菌介導法將反義CmSS1基因轉化甜瓜，經PCR檢測，得到5株轉基因植株。這為以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性調節(jié)機制及通過基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基礎。

關鍵詞：甜瓜；蔗糖合成酶；反義表達載體；遺傳轉化

中圖分類號：Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）04-0004-04

甜瓜（ Cucumis melo L ） 是重要的園藝植物，是世界公認的十大健康水果之一，一直以其獨特的風味備受青睞。甜瓜品質主要取決于可溶性糖的種類和含量。成熟甜瓜中大于97%的可溶性固形物是可溶性糖，而蔗糖占60%左右[1]。因此，國內外許多學者對甜瓜果實發(fā)育過程中可溶性糖的積累

進行了研究。張明方等[2]研究得出，在完熟的甜瓜果實中，蔗糖含量占了總糖含量的70%以上，因此蔗糖含量的多少決定著甜瓜質量的優(yōu)劣； Lingle等[3]對網紋甜瓜果實發(fā)育的研究表明：甜瓜果實可溶性固形物的含量是衡量網紋甜瓜商品等級的重要標準。目前的研究認為甜瓜中蔗糖的含量主要取決于轉化酶（Invertase，Inv）、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate Synthase，SPS）和蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS），已經有學者對前兩種酶在甜瓜中的具體功能進行了研究，得出這兩種酶主要促進蔗糖的合成[4～7]。通過查閱資料得知，SS既可以促進蔗糖合成又可以起分解作用，但是一般認為SS起分解蔗糖的作用。

本試驗旨在構建CmSS1的反義植物表達載體，并通過農桿菌介導法轉化到甜瓜中，為進一步研究該基因在甜瓜中的表達及生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

11試驗材料

111質粒和菌株大腸桿菌 DH5α、植物表達載體 pBI121 均為山東農業(yè)大學園藝學院實驗室保存，甜瓜種子由山東農業(yè)大學園藝學院實驗室提供。

112主要試劑限制性內切酶、T4連接酶、 膠回收試劑盒、pMD18-T 等購自大連寶生物公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其他試劑為國產分析純。

113培養(yǎng)基 種子生長培養(yǎng)基：MS固體培養(yǎng)基；（預）共培養(yǎng)： MS+2 mg/L 6-BA；篩選培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；分化培養(yǎng)基：MS+1 mg/L 6-BA+75 mg/L K+500 mg/L Cef；伸長培養(yǎng)基：MS+05 mg/L 6-BA+50 mg/L K +250 mg/L Cef；生根培養(yǎng)基：MS+05 mg/L IAA+25 mg/L K +125 mg/L Cef[8～10]。上述培養(yǎng)基若加入抗生素，均需將無菌的培養(yǎng)基置于超凈工作臺上，待培養(yǎng)基冷卻至60℃后，再將無菌的抗生素加入。

12試驗方法

121SS基因表達載體 PBI121-CmSS1 的構建 按常規(guī)堿裂解法提取 pMD18 -T-CmSS1和pBI121 質粒， 分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切， 酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后， 用膠回收試劑盒分別回收目的基因片段和 pBI121 大片段，將兩者以 1∶3 的比例混合， 用T4 DNA連接酶16℃連接過夜， 取 10 μl連接產物轉化大腸桿菌DH5α， 將菌液均勻涂布于 LB（Kan 50 mg/L） 平板上， 37℃倒置培養(yǎng)過夜， 堿法提取質粒， 經 PCR驗證、BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切驗證陽性克隆。

122植物材料的準備選取飽滿新鮮的種子，去除堅硬的外皮，用70%酒精處理1 min，無菌水沖洗3遍，然后用07%的NaClO浸泡15 min，用無菌水沖洗后，濾紙吸干，接種到MS固體培養(yǎng)基上，在甜瓜子葉由黃轉綠時，將子葉橫切一分為二，接種于培養(yǎng)基上，在黑暗與光照條件下預培養(yǎng)2 d，即用于轉化。

123外植體的轉化[11]①接種已經轉入植物表達載體的農桿菌單克隆，在含有Kan的YEP培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜，取1 ml菌液轉入10 ml不含抗生素的YEP培養(yǎng)基中進行活化。振蕩至OD600為02～03，離心收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基懸浮稀釋10倍。

②將預培養(yǎng)后的外植體侵入農桿菌10 min，放入到培養(yǎng)基中，在黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。

③培養(yǎng)的外植體，用滅菌水（含有Kan和頭孢霉素）洗3次，再用MS液體培養(yǎng)基洗一次，放入到分化培養(yǎng)基上，28℃下篩選培養(yǎng)。

④待芽體長至1 cm左右時，切下芽體移入培養(yǎng)基中。等芽體長至2～3 cm時，轉入到生根培養(yǎng)基中。待根系發(fā)育好后，揭開組培瓶的封瓶膜，往瓶中加水以保證適當的濕度。在室內煉苗2～3 d，轉入到營養(yǎng)缽中，在大田中進行種植。

124PCR檢測①甜瓜幼苗總DNA提?。?取4～5葉齡的轉基因植株，按照SDS法提取總DNA。②PCR反應：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35個循環(huán)；延伸72℃ 10 min。反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2 1甜瓜SS基因表達載體的構建

3小結與討論

本試驗中采用的植物表達載體酶切后的PBI121大小為14 kb，與目的基因比較難連接，因此采用高效率的T4連接酶，同時對目的基因與植物表達載體的連接比例進行優(yōu)化。最后得出兩者的摩爾比為1∶3時效果最佳，這與馬樂園等[12]人的研究結果相同。

在轉化過程中，農桿菌必須具有很高的活性。因此，我們在試驗中使對數期菌液的濃度為02～03，這與陸璐等[13]的研究相同，這樣才能保持細菌的活力最高，侵染力最強；一旦濃度過大，超過對數期，細菌的活力就會明顯下降，侵染力降低，不利于轉化。

外植體浸泡的時間：時間過長，會引起毒害作用；時間過短，轉化的頻率會降低，因此，在浸泡時，一定要選擇一個合適的浸泡時間來提高轉化效率。

反義技術在植物育種研究中有著重要應用，根據胡蘿卜SS的cDNA在35S CaMV啟動子調控下反義表達和轉化植株的情況，發(fā)現(xiàn)轉化植株的SS活性在直根中下降，蔗糖大量積累，同時有少量葡萄糖、果糖、淀粉和纖維素積累；轉化植株的表型也有明顯變化，植株、葉和根均變小，表明SS有影響植株生長的作用[14]。本試驗中的轉基因植株也出現(xiàn)了植株、葉片小于對照的現(xiàn)象。對該基因的具體功能正在進一步的驗證當中。

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