摘要：前期工作中，我們從陸地棉基因組中分離了GhBI-1基因全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建了GhBI-1過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。本研究在此基礎(chǔ)上，利用卡那初步篩選獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，通過(guò)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，得到具有卡那抗性并且遺傳穩(wěn)定的T3代純合株系。利用不同濃度NaCl處理野生型和轉(zhuǎn)GhBI-1基因擬南芥，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥在200 mmol/L NaCl脅迫后，萌發(fā)率和生長(zhǎng)情況要好于野生型擬南芥，過(guò)量表達(dá)GhBI-1基因能夠提高擬南芥耐受鹽脅迫的能力。

關(guān)鍵詞：陸地棉；GhBI-1基因；異位表達(dá)；耐鹽性

中圖分類號(hào)：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0001-04

我國(guó)棉花種植區(qū)多為鹽堿和干旱地區(qū)，鹽害是影響棉花生長(zhǎng)的主要因素?；钚匝酰≧OS）的產(chǎn)生是高濃度鹽對(duì)植物細(xì)胞造成傷害的主要原因?；钚匝鯉缀蹩梢耘c所有生物大分子反應(yīng)，造成脂類和蛋白質(zhì)代謝異常。在高鹽脅迫下，植物細(xì)胞進(jìn)行一系列復(fù)雜的分子反應(yīng)，包括合成脅迫應(yīng)答蛋白和滲透保護(hù)物質(zhì)，這些表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)清除ROS或防止ROS破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)起到解毒作用[1]。

目前，已有多篇報(bào)道闡述了BI-1基因的功能[2～4] 。BI-1基因能夠抑制由生物或非生物脅迫引起的程序性細(xì)胞死亡[5]。BI-1蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有密切關(guān)系。BI-1蛋白包含6～7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，可能形成離子通道，調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生后的細(xì)胞死亡信號(hào)[6]。前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室利用陸地棉幼苗根部cDNA文庫(kù)中部分BI-1基因序列（500 bp），自陸地棉基因組中克隆了GhBI-1基因的全長(zhǎng)cDNA[7]。熒光定量結(jié)果表明，250 mmol/L NaCl處理72 h后，棉花幼苗根中GhBI-1的表達(dá)水平分別在處理2 h和24 h時(shí)出現(xiàn)高峰，GhBI-1基因受鹽誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[8]，暗示GhBI-1基因可能與耐鹽性相關(guān)。為了深入研究該基因的功能，構(gòu)建了由CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GhBI-1基因表達(dá)的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。本試驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)卡那篩選和PCR鑒定，獲得了過(guò)量表達(dá)GhBI-1基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥純合子。耐鹽性分析表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性較野生型擬南芥有一定程度的提高。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

14轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性檢測(cè)

將野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥純合子種子分別播種于含有0、100、200 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)14 d后，統(tǒng)計(jì)不同濃度鹽處理后種子的萌發(fā)率，觀察根部的生長(zhǎng)情況；野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥純合子種子在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，選擇生長(zhǎng)一致的擬南芥幼苗移栽到含有0、200 mmol/L NaCl的MS固體培養(yǎng)基上處理7 d，觀察它們的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)白化率。

2結(jié)果與分析

21轉(zhuǎn)基因擬南芥的卡那篩選

經(jīng)過(guò)卡那抗性篩選，得到具有抗性的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥10株，提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系均可擴(kuò)增出目的片段（860 bp），野生型擬南芥模板擴(kuò)增不出任何條帶（圖1）。將轉(zhuǎn)基因株系繁育至T3代，在含有卡那的MS平板上不再分離的株系為純合系。在T1篩選過(guò)程中符合分離比3∶1的有5個(gè)系，為單拷貝插入。我們對(duì)這5個(gè)株系進(jìn)行下一步研究。

23轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性檢測(cè)

將OE2～5的T3代種子和野生型種子播種在含不同濃度NaCl（0、100、200 mmol/L）的MS培養(yǎng)基上，在短日照培養(yǎng)14 d左右，觀察擬南芥種子的萌發(fā)情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由于在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型擬南芥種子的萌發(fā)率高于轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，因此，我們把野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率看作100%，不同濃度NaCl脅迫的萌發(fā)率以此校正為相對(duì)萌發(fā)率。在含100 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的萌發(fā)率并未受到顯著影響。在含200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，OE2、OE3的相對(duì)萌發(fā)率（89%和88%）比野生型（74%）明顯提高，OE4、OE5的相對(duì)萌發(fā)率與野生型的差別不大（表1）。

3討論與結(jié)論

BI-1是細(xì)胞凋亡的調(diào)控因子，普遍存在于原核和真核細(xì)胞中，在進(jìn)化上非常保守。缺失BI-1的小鼠未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的組織異常[9]，說(shuō)明它并不是細(xì)胞凋亡的必需因子，而是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫信號(hào)通路不僅參與植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)態(tài)平衡，還在植物的其他生物過(guò)程，如對(duì)病原體和非生物脅迫的響應(yīng)方面具有重要作用。在植物細(xì)胞中，BI-1可能具有調(diào)控由脅迫引發(fā)的程序性細(xì)胞死亡的功能[10]。

植物遭受非生物脅迫（如高鹽脅迫）后，代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致ROS增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的膜脂和膜蛋白受到鹽脅迫的直接影響，出現(xiàn)透性增大和膜脂過(guò)氧化水平升高，導(dǎo)致膜的完整性被破壞，其差別透性喪失，電解質(zhì)及某些小分子有機(jī)物大量滲漏，細(xì)胞物質(zhì)交換平衡遭到破壞，而植物防御體系被膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物的破壞又加劇了膜脂的過(guò)氧化程度[12]。ROS可能激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的程序性細(xì)胞死亡通路[13]。BI-1蛋白具有6或7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，形成離子通道，參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在ROS生成后，調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡信號(hào)[7]。