摘要：以黑莓品種‘Kiowa’無(wú)菌苗的葉片為外植體，研究了外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：不同激素種類(lèi)、濃度及其配比誘導(dǎo)‘Kiowa’的葉片都可以產(chǎn)生愈傷組織，并且誘導(dǎo)率都為100%，但愈傷組織的狀態(tài)和生長(zhǎng)量有顯著差異。其中添加2，4-D產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量較好，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合使用時(shí)有抑制愈傷組織誘導(dǎo)的作用；添加10 mg/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織多，質(zhì)地疏松，呈嫩黃色顆粒狀。

關(guān)鍵詞： 黑莓‘Kiowa’；葉片；愈傷組織；懸浮培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.204+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0051-04

黑莓（Rubus spp）是薔薇科懸鉤子屬的一種多年生漿果類(lèi)果樹(shù)[1]，原產(chǎn)于北美，其果實(shí)為聚合果，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含糖、果酸及多種維生素，有防衰老和提高人體免疫力等功效，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外興起的第三代水果之一[2，3]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

黑莓中富含維生素E[4]。以黑莓葉片為外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，再通過(guò)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)快速產(chǎn)生大量的含維生素E的細(xì)胞，是一種快速增殖天然維生素E的方法。目前國(guó)內(nèi)對(duì)黑莓愈傷組織誘導(dǎo)的研究較少，更沒(méi)有利用愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)獲得高產(chǎn)維生素E的報(bào)道。本試驗(yàn)以黑莓品種‘Kiowa’的葉片為外植體，研究了激素種類(lèi)、濃度以及激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，目的是篩選適于懸浮培養(yǎng)的愈傷組織的最佳誘導(dǎo)方法，為利用黑莓細(xì)胞懸浮培養(yǎng)獲得高產(chǎn)維生素E奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料

本試驗(yàn)于2012年3～6月進(jìn)行。黑莓品種‘Kiowa’無(wú)菌苗的葉片，取自中國(guó)科學(xué)院植物研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室（南京）。取葉齡30～40天的黑莓組培苗從上往下數(shù)第2～5片葉，剪去葉尖及葉緣，剪成05 cm×05 cm左右的方塊作為接種材料。接種時(shí)，使葉片背面接觸培養(yǎng)基。

12方法

121激素種類(lèi)對(duì)‘Kiowa’葉片愈傷組織的誘導(dǎo) 將‘Kiowa’組培苗的無(wú)菌葉片分別接種于附加10 mg/L 2，4-D、NAA、IAA、IBA、6-BA、KT、TDZ、ZT的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)20天后觀(guān)察、統(tǒng)計(jì)結(jié)果，比較不同激素種類(lèi)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1222，4-D濃度對(duì)‘Kiowa’葉片愈傷組織的誘導(dǎo)將‘Kiowa’組培苗的無(wú)菌葉片分別接種于附加不同濃度2，4-D（05、10、15、20、30、50 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)20天后觀(guān)察、統(tǒng)計(jì)結(jié)果，比較不同2，4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

123生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合對(duì)‘Kiowa’葉片愈傷組織的誘導(dǎo)將‘Kiowa’組培苗的無(wú)菌葉片分別接種于附加不同濃度生長(zhǎng)素（2，4-D）與不同濃度細(xì)胞分裂素（6-BA或TDZ）組合的MS培養(yǎng)基上（見(jiàn)表3、表4），暗培養(yǎng)20天后觀(guān)察、統(tǒng)計(jì)結(jié)果，比較生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

以上所有處理的基本培養(yǎng)條件是：MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度為25 g/L，瓊脂為56 g/L，pH值58～60，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。每個(gè)處理接種葉片20個(gè)，重復(fù)3次。

124愈傷組織誘導(dǎo)率的計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=（形成愈傷組織的外植體個(gè)數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100。

2結(jié)果與分析

21激素種類(lèi)對(duì)‘Kiowa’葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

激素種類(lèi)是影響植物離體器官愈傷組織發(fā)生的關(guān)鍵因素，在其培養(yǎng)中起著極為重要的調(diào)節(jié)作用[5]。由表1可以看出，當(dāng)激素濃度為10 mg/L時(shí)，不同的生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞分裂素均可誘導(dǎo)‘Kiowa’的葉片產(chǎn)生愈傷組織，且誘導(dǎo)率為100%，出愈時(shí)間基本一致，一般為7～10天，但是愈傷組織的狀態(tài)和生長(zhǎng)量有顯著差異。其中2，4-D和TDZ誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地疏松，且前者是顆粒狀，顏色比后者更為嫩黃，總體質(zhì)量也比較好，其它生長(zhǎng)素類(lèi)激素NAA、IAA、IBA雖然也能誘導(dǎo)出愈傷組織，但顏色和質(zhì)量均不符合目標(biāo)性狀的要求。比如NAA誘導(dǎo)的愈傷組織為翠綠色，IAA、IBA誘導(dǎo)的為黃綠色，且呈塊狀、質(zhì)地緊密，后期很容易生根，不利于后續(xù)的懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞分裂素類(lèi)激素6-BA、KT、ZT誘導(dǎo)的愈傷組織不僅質(zhì)地緊密，且愈傷量很少，其中6-BA、KT誘導(dǎo)出的愈傷組織呈顆粒狀黃綠色，ZT誘導(dǎo)出的愈傷組織呈塊狀黃色。由此分析認(rèn)為，只有添加2，4-D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織才最適于后續(xù)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。