摘要：綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外常見核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展，概述了目前果樹遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法，闡述了核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化植株的主要鑒定方法，指出了當(dāng)前研究中存在的一些問(wèn)題，探討了轉(zhuǎn)基因研究未來(lái)的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：核果類果樹；遺傳轉(zhuǎn)化；檢測(cè)技術(shù)；發(fā)展方向

中圖分類號(hào)：S662；Q789文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）04-0130-07

核果類果樹是指薔薇科李屬（Prunus）、果實(shí)為核果的一類果樹，包括桃、杏、李和櫻桃等，是我國(guó)落葉果樹的重要種類。果樹長(zhǎng)期的育種實(shí)踐表明，常規(guī)雜交育種方法對(duì)核果類果樹種質(zhì)改良有很大的局限性；基因工程育種周期短，基因資源豐富，能最大限度地克服物種生殖隔離的障礙，實(shí)現(xiàn)生物界遺傳物質(zhì)的自由交流。自1988年首例轉(zhuǎn)基因核桃成功報(bào)道以來(lái)[1]，基因轉(zhuǎn)化方面的研究在果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究上得到了廣泛應(yīng)用，其在果樹遺傳改良中的作用越來(lái)越受到重視。本文主要綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化方面所取得的進(jìn)展，為基因工程育種提供參考和借鑒。

1常見核果類果樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀

11桃

桃轉(zhuǎn)基因難度較大，多數(shù)研究只獲得了轉(zhuǎn)基因的愈傷組織而未能獲得轉(zhuǎn)基因植株。1991年Smigocki和Hammerschlag[2]用未成熟桃胚為外植體，經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)和再分化，成功將細(xì)胞分裂素合成酶基因（IPT）導(dǎo)入了桃，這是世界上首例也是目前為止唯一公開報(bào)道的轉(zhuǎn)基因桃實(shí)例。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法在桃遺傳轉(zhuǎn)化研究中均有報(bào)道[3～6]。

Smigocki等[8]早期利用Ti質(zhì)粒中含細(xì)胞分裂素合成酶基因和生長(zhǎng)素酶突變基因的根癌農(nóng)桿菌與桃的成熟細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行感染，獲得了桃轉(zhuǎn)化細(xì)胞及愈傷組織。Martin[9]曾用2種發(fā)根農(nóng)桿菌和8種根癌農(nóng)桿菌感染桃，證明了以GUS基因作為桃遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)告基因和測(cè)試包含GUS基因標(biāo)記系統(tǒng)的農(nóng)桿菌的有用性。Ognjanow[10]用帶有GUS基因的農(nóng)桿菌感染桃子葉轉(zhuǎn)化體，GUS熒光檢測(cè)與陰性對(duì)照明顯不同。Hammerschlag等[11]用農(nóng)桿菌tma328∶tn5轉(zhuǎn)化桃成年樹離體莖段，均產(chǎn)生了腫瘤組織，并表現(xiàn)出不依賴細(xì)胞分裂素的特性，轉(zhuǎn)化體DNA呈陽(yáng)性，初次說(shuō)明了成年桃樹的細(xì)胞能夠被轉(zhuǎn)化及根癌菌具有轉(zhuǎn)化重要基因到桃樹上的潛能。1991年他們又用tma328∶tn5感染未成熟桃胚，將共培養(yǎng)后的外植體接種在無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，這些愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化產(chǎn)生了芽。Ye等[6]用基因槍法轟擊桃未成熟胚、胚軸、子葉、莖尖、葉片和長(zhǎng)期胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化GUS/NPTⅡ嵌合基因，所有類型的外植體均獲得了GUS基因瞬時(shí)表達(dá)，并在長(zhǎng)期胚性愈傷組織中得到穩(wěn)定表達(dá)。他們篩選出了桃組織遺傳轉(zhuǎn)化的最優(yōu)組合，并用微粒轟擊法使外源基因成功導(dǎo)入桃胚愈傷組織并得到穩(wěn)定表達(dá)。金勇豐等[12，13]已先后從桃品種“玉露”克隆了ACC氧化酶和ACC合酶的基因，且已構(gòu)建其反義植物表達(dá)體系，若轉(zhuǎn)化桃獲得成功，可望阻抑果實(shí)軟化期該基因的表達(dá)，從而提高果實(shí)的耐貯性?，F(xiàn)已成功獲得導(dǎo)入了ACC氧化酶反義基因的轉(zhuǎn)基因桃植株[12]，目前正在培育以觀察轉(zhuǎn)基因果實(shí)的性狀。

李曜東等[14]將肥城桃反義PG基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化組培苗，轉(zhuǎn)化苗在含卡那霉素培養(yǎng)基上篩選，獲得抗卡那霉素轉(zhuǎn)基因苗。吳延軍等[15]以桃幼胚作為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的受體，通過(guò)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率的分析，研究出了該轉(zhuǎn)化體系的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。Pérez-Clemente等[3]2004年報(bào)道以GFP為內(nèi)部標(biāo)記鑒定轉(zhuǎn)基因桃樹。萬(wàn)春雁等[7]2009年對(duì)桃花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行初步研究，探索一種建立于組織培養(yǎng)之外的轉(zhuǎn)基因方法。

12李

除了桃，其它核果類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究也得到廣泛開展。1991年，Mante等[16]首先實(shí)現(xiàn)了西洋李轉(zhuǎn)基因，目前已在波蘭、羅馬尼亞和西班牙等3個(gè)不同氣候條件的國(guó)家進(jìn)行了溫室和大田試驗(yàn)。Scorza等[17，18]在李樹上轉(zhuǎn)化木瓜環(huán)斑病毒（PRV）外殼蛋白基因，并就轉(zhuǎn)基因植株對(duì)李痘病毒（PPV）的反應(yīng)進(jìn)行了初步研究。1994年，Scorza等[19]成功利用帶有重組質(zhì)粒PGA482 gg/PPV-CP-33的致瘤農(nóng)桿菌與下胚軸切段共培養(yǎng)獲得了轉(zhuǎn)PPV外殼蛋白基因的歐洲李轉(zhuǎn)基因莖，在歐洲和地中海地區(qū)用于防治核果類重要病害的發(fā)生。Ravelonandro等[20～23]先后幾年致力于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抵御李痘病侵染的研究；Yancheva等[24]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了李樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究；Malinowski等[25]2006年成功進(jìn)行了李樹轉(zhuǎn)PPV-CP基因的田間試驗(yàn)；2008年Urtubia等[26]在中國(guó)李子兩個(gè)變種“Angeleno”和“Larry Anne”上用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化NPTⅡ和GFP兩種基因，并成功進(jìn)行了檢測(cè)；2011年，Ilardi等[27]研究并報(bào)道了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)防止李痘病毒在草本寄主和核果類果樹上侵染的相關(guān)研究成果。至今，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在李樹上的應(yīng)用已取得了一定成績(jī)，并在一直不斷地研究與進(jìn)步。

13杏

1992年Machado等[28]首次通過(guò)致瘤農(nóng)桿菌將PPV外殼蛋白基因成功轉(zhuǎn)入杏的Kecskemeter品種，是杏轉(zhuǎn)基因的首次成功。而后，Machado等[29]又進(jìn)行了利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在草本模式寄主以及杏、李上防治PPV的相關(guān)研究。2004年，Petri等[30]以杏樹葉片為試材，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的影響因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，并成功篩選出最優(yōu)因子。隨后，有人對(duì)氨基糖苷類抗生素[31]、植物生長(zhǎng)素、多胺與乙烯抑制劑等因素對(duì)轉(zhuǎn)基因杏樹葉組織選擇及再生作用進(jìn)行了研究報(bào)道[32]；也有研究表明，轉(zhuǎn)化PRV外殼蛋白到杏樹上會(huì)提高杏樹對(duì)PPV的抗性 [17，18，33]。2007年，宮雪超等[34]報(bào)道了利用Southern雜交法對(duì)轉(zhuǎn)基因杏和柑橘進(jìn)行檢測(cè)與鑒定?？傊?，杏樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究已在方法、效率以及檢測(cè)等方面取得了巨大進(jìn)步。

14扁桃

1995年，Archilleti等[35]報(bào)道了用含有NPTⅡ基因的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化扁桃品種MN51和Supernova葉片，試驗(yàn)了不同的細(xì)菌濃度、共培養(yǎng)時(shí)間和卡那霉素選擇前的培養(yǎng)時(shí)間，以期建立有效的轉(zhuǎn)化和再生體系。Miguel等 [36]于1999年獲得第一株轉(zhuǎn)基因扁桃植株，他用離體培養(yǎng)的葉片外植體為起始材料首次建立了表達(dá)NPTⅡ和GUS基因的扁桃品種Boa Casta轉(zhuǎn)基因克隆，有3個(gè)克隆是嵌合體；與帶有相同質(zhì)粒的菌株LBA4404相比，EHA105轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子的GUS陽(yáng)性頻率和GUS表達(dá)單位更高。2000年，Ainsley [37]對(duì)扁桃基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了論述；Ramesh等[38]于2006年對(duì)以扁桃為材料的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行了部分改進(jìn)，建立了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，扁桃遺傳轉(zhuǎn)化取得了較快進(jìn)展。

15櫻桃

第一例轉(zhuǎn)基因櫻桃于1998年首次報(bào)道[39]，1999年Dolgov等[45]報(bào)道了酸櫻桃的重組轉(zhuǎn)化，我國(guó)科學(xué)家方宏筠等[40]也于1999年成功地將抗菌肽基因?qū)霗烟?。Bhagwat等[41]2004年報(bào)道了甜櫻桃拉賓斯和甜心的體外遺傳重組；Song等[42]于2005年對(duì)酸櫻桃農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)因素及芽再生條件進(jìn)行了優(yōu)化，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在櫻桃上的應(yīng)用獲得了較快發(fā)展。張開春等[43]從圓葉櫻桃中克隆了多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）基因，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)操縱櫻桃果實(shí)的成熟和軟化奠定了良好的基礎(chǔ)。Dolgov等[44，45]已獲得7個(gè)含有抗凍基因的酸櫻桃轉(zhuǎn)化系，目的是為了防止春季霜凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，但遺憾的是未在轉(zhuǎn)化植物中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

用6個(gè)不同的帶有pBI121的野生型農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化酸櫻桃，獲得了含有NPTⅡ和GUS基因的轉(zhuǎn)基因莖[46]。在一種顯著抗霜凍櫻桃砧木（Psubhirtella cv.autumnorosa）中，用致瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的GUS基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測(cè)定了胚性培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化效率[47]。用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將35S啟動(dòng)子和CAM啟動(dòng)子引導(dǎo)的帶有BAR和GUS基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入櫻桃矮化砧木Inmil（P incisa×P.serrulata GM9）和Damil（Pdawyckensis GM61/1）以及甜櫻桃品種Summit（P avium L），在未加選擇劑的情況下產(chǎn)生了嵌合的再生植株[48]?？傊?，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在櫻桃育種方面取得了較快發(fā)展。

2核果類果樹的遺傳轉(zhuǎn)化方法及影響因素

21農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌的體內(nèi)含有一些很大的質(zhì)粒，在原質(zhì)粒上有一段DNA稱為T-DNA，在土壤農(nóng)桿菌侵入細(xì)胞時(shí)，T-DNA能夠插入植物細(xì)胞的基因組并穩(wěn)定遺傳給新分裂的細(xì)胞。人們利用T-DNA的這一特點(diǎn)，將其中能導(dǎo)致植物形成腫瘤的基因全部切除，換上需要的目的基因，就組成了一個(gè)可將目的基因帶進(jìn)植物細(xì)胞中去的載體。目前，核果類轉(zhuǎn)基因最常用的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程是把Ti質(zhì)粒的T-DNA片段轉(zhuǎn)移到植物的核基因組。此方法的轉(zhuǎn)化效率受以下幾方面因素的影響：（1）細(xì)菌的菌株對(duì)轉(zhuǎn)化頻率影響很大。在核果類果樹上最常用的Ti質(zhì)粒菌株為L(zhǎng)BA4404、EHA105和EHA101，而常用的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株則是1855NCPPB和ATCC15834，外植體和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間一般為24～36 h，向培養(yǎng)基中加入抗生素（如：羧芐青霉素）來(lái)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，共培養(yǎng)后，除菌十分關(guān)鍵；（2）轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。常用卡那霉素，因?yàn)楹斯惖拇蠖鄶?shù)種質(zhì)對(duì)卡那霉素高度敏感，卡那霉素的濃度和加入時(shí)間根據(jù)外植體和物種的不同進(jìn)行預(yù)先實(shí)驗(yàn)；（3）轉(zhuǎn)化細(xì)胞能否高效地再生是轉(zhuǎn)化的主要問(wèn)題，核果類果樹再生困難；（4）導(dǎo)入的外源DNA在植物基因組中的穩(wěn)定性，避免外源基因的瞬時(shí)表達(dá)和形成嵌合體。

22基因槍法

基因槍是1987年美國(guó)康奈爾大學(xué)Sanford等人首先發(fā)明的，是憑借高速運(yùn)動(dòng)的金屬微粒將附著其表面的核酸分子引入到受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù)[49]?；驑尫ㄒ渤Ｓ糜诠麡涞倪z傳轉(zhuǎn)化，基因槍微彈轟方法可用于任何植物組織的轉(zhuǎn)化，而且報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)便于分析基因表達(dá)的組織特異性，但獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的頻率較低。Ye等[6]用基因槍轟擊桃外植體

轉(zhuǎn)化GUS/NPTⅡ嵌合基因，并在長(zhǎng)期胚性愈傷組織中得到GUS基因的固定表達(dá)。此方法的轉(zhuǎn)化效率受以下幾方面因素的影響：（1）基因槍轟擊參數(shù)：DNA 包裹和射擊過(guò)程中的各種物理參數(shù)因基因槍類型不同而有所差別。以PDS-1000/He 型基因槍為例，金粒形狀較均勻，對(duì)受體細(xì)胞沒(méi)有太大的損傷，轉(zhuǎn)化效果較好。氦氣的壓力是決定金屬粒子飛行速度的主要因素，壓力過(guò)大會(huì)對(duì)植物細(xì)胞造成傷害，壓力過(guò)小，金屬粒子不能進(jìn)入細(xì)胞。此外，金屬粒子大小、載體膜的位置和靶材料的位置等參數(shù)，也與其他射擊參數(shù)相互聯(lián)系，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體設(shè)置。（2）微彈射程：微彈射程指基因槍擋板與靶細(xì)胞間的距離，它是影響基因轉(zhuǎn)化率的重要因素，植物組織中只有特定的細(xì)胞具有再生能力，需根據(jù)受體材料選擇合適的距離；轉(zhuǎn)化率與彈膛內(nèi)的真空度呈正相關(guān)關(guān)系，但要考慮靶細(xì)胞對(duì)真空度的耐受性；適當(dāng)?shù)霓Z擊次數(shù)有利于目的基因的表達(dá)，轟擊次數(shù)過(guò)多往往會(huì)使轟擊細(xì)胞損傷嚴(yán)重，降低轉(zhuǎn)化率；DNA 的純度和濃度均會(huì)影響轉(zhuǎn)化率，目前普遍采用的DNA 濃度為1 g/L；氯化鈣與亞精胺常用作DNA 的沉淀劑，其濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率也有影響。Klein 報(bào)道氯化鈣的最適宜濃度為19～24 mol/L，亞精胺的最適宜濃度為769×10-3～769×10-3 mol/L[49]。（3）受體的生理因素：受體的生理因素主要指受體細(xì)胞或組織的生理狀態(tài)。一般認(rèn)為，生理活性高的組織或細(xì)胞有利于外源DNA 的攝入與整合，選用再生能力強(qiáng)的外植體作為轉(zhuǎn)化受體，提高轉(zhuǎn)化率。

主要的基因轉(zhuǎn)化方法除了上述兩種方法外，還有微注射法、電擊法和花粉管通道法[7]。如Vardi等[50]用PEG法將CAT基因和NPTⅡ基因?qū)霗幟试|(zhì)體獲得再生植株；Oliveira[51]用電擊法及PEG法轉(zhuǎn)化獼猴桃原生質(zhì)體獲得成功。木本果樹遺傳轉(zhuǎn)化上應(yīng)用的方法還有DNA直接攝取法[52]、碳化硅法[53]、電泳法[54]等。

3轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)鑒定

遺傳轉(zhuǎn)化后，先通過(guò)抗性篩選獲得抗性芽后生成植株，再對(duì)抗性植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性的植株才是真正的轉(zhuǎn)基因植株。常用的檢測(cè)方法有GUS活性檢測(cè)、PCR技術(shù)雜交檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)。

31GUS活性檢測(cè)

GUS基因是研究外源基因瞬時(shí)表達(dá)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中的報(bào)告基因。GUS 基因3′端與其他結(jié)構(gòu)形成的融合基因能正常表達(dá)，所產(chǎn)生的融合蛋白仍具有GUS 活性，這為研究外源基因表達(dá)的具體細(xì)胞部位及組織部位提供了條件，這是它的一大優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要設(shè)定嚴(yán)格的陰性對(duì)照，GUS 活性的檢測(cè)方法有很多，包括組織化學(xué)法、色譜法、熒光法等。GUS活性檢測(cè)多采用組織化學(xué)染色法，轉(zhuǎn)化組織與對(duì)照組織相比呈可區(qū)分的藍(lán)色。GUS活性檢測(cè)是柑橘[55]轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)的一種常規(guī)方法，在轉(zhuǎn)基因植株鑒定中有著廣泛應(yīng)用。

32PCR技術(shù)

轉(zhuǎn)基因植物核酸水平上的檢測(cè)實(shí)質(zhì)是檢測(cè)插入的外源基因，主要的檢測(cè)方法是多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)。PCR技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù)，主要有常規(guī)定性PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)（MPCR）、PCR-GeneScan、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）、電化學(xué)發(fā)光PCR （ECL-PCR）、PCR-ELISA法。其中，PCR-ELISA 法能半定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分含量；qRT-PCR 能定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因含量，且采用閉管分析，有效消除了核酸的交叉污染，是適合植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)鑒定的一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用的方法?？傮w來(lái)說(shuō)，PCR 反應(yīng)靈敏度較高，但易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，常采用Southern 雜交、酶切、測(cè)序等進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果。PCR已成功用于柑橘轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)[55]；楊東燕等[56]采用PCR技術(shù)建立了對(duì)抗環(huán)斑病毒轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1進(jìn)行品系鑒定的檢驗(yàn)方法。

33雜交檢測(cè)

外源基因?qū)胫参锖螅D(zhuǎn)基因植株在DNA、RNA及蛋白質(zhì)水平上均與對(duì)照存在差異，這三種水平的差異可分別通過(guò)Southern雜交、Northern雜交和Western雜交得到檢測(cè)。核酸分子雜交是根據(jù)外源基因序列設(shè)計(jì)探針，將探針與待測(cè)核苷酸序列雜交，由雜交結(jié)果判斷待測(cè)基因片段是否與已知外源基因同源。核酸分子雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因成分具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但雜交程序復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，用于檢測(cè)所轉(zhuǎn)化植株中外源基因的整合（Southern 雜交）和表達(dá)（Northern雜交），有時(shí)也用來(lái)驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株都采用Southern雜交檢測(cè)基因是否整合，在柑橘、杏的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[34]。而通過(guò)Northern或Western雜交則可以檢測(cè)基因是否表達(dá)，Northern雜交于草莓中得到廣泛應(yīng)用[34]。

34免疫學(xué)檢測(cè)

免疫學(xué)檢測(cè)是蛋白質(zhì)水平的一種檢測(cè)方法，主要的方法是免疫酶聯(lián)吸附法（ELISA）。ELISA原理是利用抗原和抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。陳松等[57]和秦崇濤等[58] 研究表明雙抗夾心ELISA 法能對(duì)轉(zhuǎn)基因含量進(jìn)行定量檢測(cè)。基于ELISA 法的改進(jìn)方法還有試紙檢測(cè)，與常規(guī)ELISA相比，不同之處是以硝化纖維代替聚苯乙烯反應(yīng)板為固相載體，外源蛋白特異結(jié)合的抗體上聯(lián)結(jié)了顯色劑被固定在試紙條內(nèi)，檢測(cè)時(shí)只需將試紙條插入待測(cè)樣品的提取物中，就可以快速測(cè)定被測(cè)樣品中是否含有被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因蛋白。目前國(guó)內(nèi)已有用一張?jiān)嚰垯z測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄[59]的報(bào)道。應(yīng)用ELISA 法和試紙條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，只限于幾個(gè)種類，主要是因?yàn)橛行┎迦氲耐庠椿虮旧聿槐磉_(dá)蛋白質(zhì)或表達(dá)量很低或表達(dá)量變化很大，很容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且制備特異的酶標(biāo)抗體較為復(fù)雜。

綜合目前的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)手段，雖然檢測(cè)方法豐富，但都有其優(yōu)勢(shì)和不足。目前國(guó)內(nèi)已經(jīng)建立了大豆、油菜、玉米、蔬菜、煙草、飼料、食品等的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系，但尚未建立有效的水果轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系，因此，完善轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系和建立果樹轉(zhuǎn)基因體系意義深遠(yuǎn)。

4果樹轉(zhuǎn)基因研究存在的問(wèn)題和展望

果樹轉(zhuǎn)基因雖然取得了較快的發(fā)展，但研究中還存有一些潛在問(wèn)題：食品安全性問(wèn)題、病蟲的抗性問(wèn)題、環(huán)境生態(tài)平衡問(wèn)題等。另外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)方面也存在一些問(wèn)題：轉(zhuǎn)基因尚未能定點(diǎn)、定量導(dǎo)入受體基因組中并獲得穩(wěn)定、高效的表達(dá)和遺傳，且又不影響受體生物原有優(yōu)良性狀的表達(dá)。如：AC/DS轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的載體，其宿主范圍廣，提高了轉(zhuǎn)化效率，并能有效地將大片段DNA以完整的單拷貝方式整合到宿主染色體上。再如：利用核基質(zhì)附著區(qū)序列，將轉(zhuǎn)基因與周圍染色質(zhì)分離開來(lái)，使轉(zhuǎn)基因表達(dá)不受染色體上整合位點(diǎn)的影響，形成一個(gè)獨(dú)立調(diào)節(jié)的染色質(zhì)區(qū)域，這樣轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平就會(huì)隨拷貝數(shù)增加而明顯增強(qiáng)。

展望果樹遺傳轉(zhuǎn)化工程，未來(lái)的研究應(yīng)集中在下列幾個(gè)方面：（1）進(jìn)一步建立完善高效穩(wěn)定的果樹目的基因的轉(zhuǎn)化體系；（2）加快果樹目的基因的分離與克隆。除利用模式植物中已轉(zhuǎn)化成功的目的基因外，加快果樹本身基因的分離已成當(dāng)務(wù)之急；（3）開展果樹轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；（4）加大對(duì)果樹基因工程生物安全性及生態(tài)問(wèn)題的關(guān)注。

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