摘要：應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)對健康仔豬與黃白痢仔豬的糞樣樣品進行了擴增，并對其菌群結(jié)構(gòu)特征進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康仔豬糞樣ERIC-PCR圖譜相似性較黃白痢仔豬高，仔豬腸道菌群中至少有一種類型的細菌異常增殖，影響正常細菌的正常生存，導(dǎo)致了菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，造成黃白痢。基于ERIC-PCR的分子生物學(xué)技術(shù)來反映仔豬腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征和監(jiān)測生物種群動態(tài)是有效可行的。通過ERIC-PCR的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)患黃白痢仔豬糞樣菌群多樣性減少，結(jié)構(gòu)趨于簡單化；健康仔豬個體之間條帶的數(shù)量、位置及灰度基本一致，其中共有一些優(yōu)勢條帶。

關(guān)鍵詞：ERIC-PCR；菌群結(jié)構(gòu)；系統(tǒng)分析

中圖分類號：S852.6 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）02-0021-02

動物消化道微生物對其宿主在生命活動中扮演著十分重要的角色，這些微生物在消化道內(nèi)形成一個相對穩(wěn)定的、開放的微生態(tài)系統(tǒng)，并在宿主的整個生命過程中起著重要作用。當(dāng)某種原因破壞了這一穩(wěn)定的生態(tài)平衡，即出現(xiàn)生態(tài)失調(diào)反應(yīng)，影響動物健康[1]。仔豬黃白痢與腸道菌群失調(diào)存在一個互為因果的關(guān)系，所以，研究腹瀉癥狀動物的腸道菌群結(jié)構(gòu)不僅可以弄清楚消化等生理機制的基礎(chǔ)，更有助于診斷和治療各種由微生物引起的腸道疾病[2-5]。純培養(yǎng)方法的局限在于腸道內(nèi)絕大多數(shù)未知菌，目前無法用現(xiàn)有的技術(shù)培養(yǎng)，而分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展為解決這個難題帶來了希望[6]。

ERIC-PCR可以用于分析人工培養(yǎng)的混合菌甚至是天然復(fù)雜微生物群落的組成特征[7]。本試驗利用ERIC-PCR技術(shù)研究健康仔豬與黃白痢仔豬糞樣的菌群差異，旨在了解腸道菌群與仔豬黃白痢的發(fā)生之間存在的因果規(guī)律。本研究分別提取健康仔豬與黃白痢仔豬糞便樣品中細菌基因組DNA，經(jīng)ERIC-PCR后，對產(chǎn)物進行電泳檢測和圖譜分析，分別得出健康仔豬與黃白痢仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)特征。

1 材料

1.1 糞便樣品

健康仔豬糞便樣品1 000份，黃白痢仔豬糞便樣品5 000 份，于2010年1～4月采自牟平富海種豬場 1～10日齡的仔豬。分別置于-20 ℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

DNA Marker DL2000（生產(chǎn)批號：038）購自西安沃爾森生物技術(shù)科技有限公司；2×PCR Taq酶（生產(chǎn)批號：P-2011）購自廣州東盛生物技術(shù)科技有限公司。

低溫離心機；PTC-100TM PCR擴增儀；DYY-Ⅲ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，英國）；SK-1漩渦快速混勻器。

1.3 引物設(shè)計

ERIC-PCR引物設(shè)計參照Versalovic（1991），見表1（由大連寶生物公司合成）。

2 方法

2.1 細菌基因組DNA的抽提

酚-氯仿抽提法提取細菌基因組做為ERIC-PCR的模板。具體步驟如下：稱取1 g左右糞便樣品，放入10 mL離心管中；向離心管中加入6 mL TE緩沖液，漩渦震蕩2 min，600 r/min離心5 min；將上清液小心轉(zhuǎn)入另一10 mL 離心管中，加入TE緩沖液到總體積為5 mL，并配平，漩渦振蕩2 min，1 000 r/min離心5 min；將上清液小心轉(zhuǎn)入另一10 mL 離心管中，加入TE緩沖液到總體積5 mL，并配平，1 200 r/min離心5 min；取上清液，6 000 r/min 離心10 min；棄上清液，將沉淀加入1 mL TE緩沖液溶解并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 mL 預(yù)冷的丙酮，充分漩渦清洗細菌，6 000 r/min離心5 min；將上述步驟重復(fù)2～3次，直到整個菌液中雜色減到最低為止；棄去上清液取下部細菌沉淀，加入100 μL TE和50 μL溶菌酶，37 ℃水浴30 min；加入200 μL裂解液和10 μL蛋白酶K，55 ℃水浴1～3 h；加等體積酚，上下顛倒混勻，靜置2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液于另一管中；加等體積V（酚）：V（氯仿）：V（異戊醇）=25：24：1的溶液，上下顛倒混勻，靜置2 min，12 000 r/min離心6 min 取上清液于另一管中；加等體積V（氯仿）：V（異戊醇）=24：1的溶液，上下顛倒混勻靜置2 min，12 000 r/min離心6 min，取上清液于另一管中；加入等體積異丙醇-20 ℃靜置30 min，14 000 r/min離心6 min，去上清液，待異丙醇揮發(fā)后加入20 μL TE 溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ERIC-PCR

反應(yīng)體系：25 μL的PCR反應(yīng)液中，2×Taq master mix 12.5 μL，20 pmol/L上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補充至25 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃ 7 min，30 個循環(huán)（94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min），65 ℃ 15 min，4 ℃保存。

2.3 PCR產(chǎn)物電泳檢測

取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，加樣于15 g/L瓊脂糖凝膠，以10 V/cm的電場強度于1×TAE緩沖液中電泳35 min，于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

2.4 圖譜分析

凝膠顯色定影后，用GS-800灰度掃描儀（Bio-Rad）掃描，采用分子分析軟件包（MolecularAnalys，Bio-Rad）對DGGE凝膠進行分析。

3 結(jié)果

3.1 糞樣菌群結(jié)構(gòu)特征分析

本試驗對黃白痢仔豬糞樣和健康對照仔豬的糞樣進行了ERIC-PCR擴增（見圖1）。每個時間點采集的仔豬糞樣ERIC-PCR均重復(fù)3次以上，所得圖譜均顯示較好的重復(fù)性。

圖譜上較亮的擴增條帶反映了糞樣中的優(yōu)勢菌群，條帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性說明了菌群的多樣性。由圖1可知，健康仔豬糞樣的擴增條帶數(shù)量均比黃白痢仔豬多，擴增圖譜位置等都不同。

3.2 健康仔豬糞樣微生物區(qū)系分析

由圖1可見，健康仔豬個體之間條帶的數(shù)量、位置及灰度基本一致，在490 bp處有共有條帶。健康仔豬糞樣ERIC-PCR圖譜相似性較黃白痢仔豬高，提示健康仔豬個體之間具有較高的相似菌群。

3.3 黃白痢仔豬糞樣微生物區(qū)系分析

從圖1可以看到，A1-4和B1-4 是黃白痢仔豬糞便樣品的腸道菌群結(jié)構(gòu)指紋圖譜。從中不難發(fā)現(xiàn)，黃白痢仔豬糞便樣品和健康仔豬糞便樣品的圖譜特點有明顯的不同，主要表現(xiàn)在黃白痢仔豬糞便樣品的腸道菌群結(jié)構(gòu)圖譜條帶較少，也比較混亂，而且大多數(shù)黃白痢仔豬糞便樣品菌群結(jié)構(gòu)圖譜在1 100 bp和300 bp處有兩條共有條帶，以上說明了這些仔豬腸道菌群中至少有一種類型的細菌異常增殖，影響正常細菌的正常生存，導(dǎo)致了菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)，造成黃白痢[8，9]。

4 結(jié)論

基于ERIC-PCR的分子生物學(xué)技術(shù)來反映仔豬腸道微生物群落結(jié)構(gòu)特征和監(jiān)測生物種群動態(tài)是有效可行的。通過ERIC-PCR的動態(tài)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)患黃白痢仔豬糞樣菌群多樣性減少，結(jié)構(gòu)趨于簡單化；健康仔豬個體之間條帶的數(shù)量、位置及灰度基本一致，其中共有一些優(yōu)勢條帶。

參考文獻：

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