摘要：本實(shí)驗(yàn)以加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）的方案為基礎(chǔ)，以高粱為材料進(jìn)行研究并加以改良。

關(guān)鍵詞：高粱；ISSR；多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S514 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0432（2012）-11-0053-1

1994年加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等人建立了簡(jiǎn)單重復(fù)間序列標(biāo)記分子標(biāo)記技術(shù)即Inter-simple sequence repeat（ISSR）。原理是簡(jiǎn)單重復(fù)間序列廣泛存在的性，在簡(jiǎn)單重復(fù)間序列的5 '端或3 '端加2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，構(gòu)建長(zhǎng)度為16-18bp的引物，利用此引物對(duì)基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，映后以電泳條帶的有無及其相對(duì)位置為信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)分析不同樣品間ISSR標(biāo)記的多態(tài)性。

目前，常用的分子標(biāo)記技術(shù)中：AFLP試驗(yàn)難度大、成本高，RAPD再現(xiàn)性較差，SSR只適用于已經(jīng)基因組信息的特種，ISSR技術(shù)則成功的克服了這些困難，但是ISSR分子標(biāo)記技術(shù)需要對(duì)PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序等條件進(jìn)行優(yōu)化與摸索造成其一定的缺陷。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高粱種子由吉林省農(nóng)科院提供；引物由北京生工合成；PCR所用試劑及酶購(gòu)于北京鼎國(guó)生物公司；常規(guī)化學(xué)試劑購(gòu)于北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；電泳設(shè)備購(gòu)于北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；基因擴(kuò)增儀購(gòu)于杭州博日科技有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于北京TIANGEN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高粱基因組DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)使用TIANGEN公司的植物基因組DNA提取試劑盒產(chǎn)品，提取高粱基因組DNA，操作方案如下：

1.取0.1g左右高粱葉片置研缽中，加液氮研磨充分。

2.轉(zhuǎn)移研磨好的粉末至裝有65℃預(yù)熱的700ul GP1緩沖液的離心管中（GP1中含0.1%巰基乙醇），輕柔傾倒數(shù)次，30min 65℃水浴裂解，顛倒離心管數(shù)次于水浴過程中以充分混勻樣品。

3.裂解結(jié)束后加入700ul氯仿，混勻，12000rpm離心10min。

4.上層水相轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，加GP2緩沖液700ul，混勻。

5.轉(zhuǎn)移上述液體至CB3吸附柱上，離心12000rpm1min，棄廢液。

6.加含乙醇的GD緩沖液 500ul到CB3吸附柱上，12000rpm1min離心，棄廢液，CB3吸附柱放回收集管。

7.加含乙醇的PW洗滌液700ul到吸附柱CB3上，12000rpm1min離心，棄廢液，CB3吸附柱放回收集管。

8.加漂洗液PW500ul到吸附柱CB3上，12000rpm1min離心，棄廢液。

9.CB3吸附柱放回收集管，12000rpm2min離心，棄廢液。把吸附柱CB3室溫下放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10.取一個(gè)干凈的離心管將CB3旅，滴加100ul滅菌ddH2O或者洗脫液到吸附膜中間部位，放置2～5min于室溫下，12000rpm離心2min收集溶液到離心管中。-20℃保存?zhèn)溆?。電泳檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量。

1.2.2 ISSR反應(yīng)條件 引物序列參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）的ISSR引物，PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行優(yōu)化篩選：94℃預(yù)變性10min；94℃變性40s，54℃～56℃退火50s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，記錄電泳結(jié)果。

1.2.3 引物的篩選 本實(shí)驗(yàn)利用供試材料中找出的形態(tài)差異較大的兩個(gè)模板對(duì)所有引物進(jìn)行初篩，再分別使用三個(gè)模板進(jìn)行隨機(jī)復(fù)篩，篩選出擴(kuò)增多態(tài)性高、條帶清晰、重復(fù)性好的引物。在篩選引物退火溫度時(shí)一般按計(jì)算的退火溫度上下浮動(dòng)1℃～3℃，設(shè)置幾個(gè)溫度梯度對(duì)所有引物篩選一次，通過比找最終結(jié)果得出最適合溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱基因組DNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)

使用植物基因組DNA提取試劑盒提取供試高粱的基因組DNA，經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見電泳圖1，從圖1我們能夠判斷出租提取的DNA具有較好的完整性，RNA去除完全，DNA質(zhì)量滿足PCR擴(kuò)增需要。

2.2 ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

影響ISSR反應(yīng)體系的四種關(guān)鍵因素分別是引物、模板DNA、Taq酶、dNTPs，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最終建立優(yōu)化方案，總反應(yīng)體積為25μl，模板DNA40ng、dNTPs0.3mmol/L、Taq酶0.5U、引物0.2μmol/L，用滅菌ddH2O補(bǔ)足25μl。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析篩選得到最佳退火溫度均為54℃。最終實(shí)驗(yàn)方案為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性40s，54℃退火50s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min；4℃保存。

3 結(jié)論

在大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上建立了適合高粱ISSR-PCR分析的最佳反應(yīng)體系：總體積25μL的反應(yīng)體系中，模板DNA 40ng、dNTPs 0.3mmol/L、Taq酶0.5U、引物0.2μmol/L，滅菌ddH2O補(bǔ)足25μl。最佳實(shí)驗(yàn)方案：94℃預(yù)變性10min；94℃變性40s，54℃退火50s，72℃延伸60s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10min，補(bǔ)齊；4℃保存。為后繼高粱種質(zhì)資源的深入研究與利用及分子育種提供了科學(xué)依據(jù)，為高粱核心種質(zhì)資源的構(gòu)建和資源的科學(xué)保存、保護(hù)提供依據(jù)。

作者簡(jiǎn)介：李樹國(guó)（1956-），男，吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授，研究方向：糧食學(xué)與生物化學(xué)；隋昌海（1981-），男，吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，研究方向：長(zhǎng)白山特色植物資源。