摘要：研究發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性情況對(duì)于了解微生物群落結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢(shì)功能菌群的動(dòng)態(tài)變化具有十分重要的意義。文章綜述了變性梯度凝膠電泳技術(shù)的基本原理、研究方法及其在發(fā)酵微生物多樣性研究中的應(yīng)用，為該技術(shù)能夠在發(fā)酵微生物分子生態(tài)學(xué)研究中得到更廣泛的應(yīng)用起到推動(dòng)作用。

關(guān)鍵詞：變性梯度凝膠電泳技術(shù)；發(fā)酵；微生物

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-0432（2012）-11-0049-2

微生物發(fā)酵是利用微生物，在適宜的條件下，將原料經(jīng)過(guò)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過(guò)程。微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平主要取決于微生物種類、菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件。因此，微生物在發(fā)酵工程中起著核心作用。在發(fā)酵的各個(gè)階段，不同的微生物發(fā)揮著不同的作用，研究發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性情況對(duì)于了解微生物群落結(jié)構(gòu)以及優(yōu)勢(shì)功能菌群的動(dòng)態(tài)變化具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，環(huán)境微生物多樣性免培養(yǎng)研究近年來(lái)逐步開(kāi)展起來(lái)，該方法克服了經(jīng)典培養(yǎng)方法的不足以及引起種群丟失等的缺陷，利用分子生物學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確高效地獲得環(huán)境樣品中各種微生物的菌落指紋和特征性核苷酸序列，確定微生物的多樣性及其分類地位，揭示和豐富了生態(tài)環(huán)境的微生物資源，突破了環(huán)境微生物多樣性研究的瓶頸，大大加速了微生物分子生態(tài)學(xué)的研究進(jìn)程。其中基于核糖體RNA（rRNA） 分子標(biāo)記的變性梯度凝膠電泳（Denaturing Dradient Gel Electrophoresis，DGGE）技術(shù)，現(xiàn)已成為開(kāi)展微生物物種多樣性和動(dòng)態(tài)變化研究的分子檢測(cè)工具之一，廣泛應(yīng)用于微生物研究領(lǐng)域。

1 DGGE分析技術(shù)的原理

DGGE分析技術(shù)最早是由Fischer等[1]在1983年提出的一種檢測(cè)點(diǎn)突變的電泳技術(shù)，Muyzer等[2]于1993年首次將這種技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究中。該技術(shù)是使用具有化學(xué)變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)一組特定引物所擴(kuò)增出的具有相同長(zhǎng)度的特定DNA片段進(jìn)行電泳，因?yàn)樘囟ㄆ螇A基序列不同，這就決定了它們具有不同的解鏈區(qū)域，因此在進(jìn)行變性梯度凝膠電泳時(shí)，長(zhǎng)度相同而在堿基序列上存在差異的DNA雙鏈的解鏈需要不同的變性劑濃度。序列不同的DNA 片段就會(huì)在各自適合的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致遷移率急劇下降，最終會(huì)停到膠的某一特定位置，這樣就可以把不同序列的DNA片段分離開(kāi)來(lái)。

2 DGGE技術(shù)的研究方法

2.1 發(fā)酵微生物宏基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增反應(yīng)

宏基因組DNA的提取是開(kāi)展發(fā)酵微生物多樣性研究的基礎(chǔ)，從發(fā)酵樣品中進(jìn)行微生物DNA的主要提取方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法即利用化學(xué)、物理和酶等手段直接作用于發(fā)酵樣品后提取DNA。常用的物理法主要有凍融和玻璃珠攪拌法等?；瘜W(xué)法主要有SDS法[3]和酶裂解法[4]等。間接法與直接法的主要區(qū)別是將發(fā)酵基質(zhì)與微生物先進(jìn)行分離再提取微生物DNA。

2.2 DGGE電泳及圖譜分析

目前在DGGE技術(shù)的應(yīng)用研究中，多采用DcodeTM基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）進(jìn)行對(duì)PCR產(chǎn)物的DGGE電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠（丙稀酰胺：雙丙稀酰胺=37.5：1）濃度為8%，變性劑濃度范圍多為30%～55%，180V電壓下，60℃恒溫，1×TAE緩沖液電泳，電泳時(shí)間根據(jù)目的產(chǎn)物大小而定。電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色，染色方法包括溴化乙錠（EB）、SYBR Green、SYBR Gold和銀染法，染色結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行分析，明確不同處理的電泳條帶多少和豐度值。

2.3 DGGE條帶的回收和序列分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌砷_(kāi)展條帶的回收和序列分析，選取各處理中目的條帶進(jìn)行產(chǎn)物回收，并以此為模板進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化后，通過(guò)菌落PCR和酶切驗(yàn)證克隆后，提取質(zhì)粒，交由生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，采用生物信息學(xué)軟件分析序列，確定微生物種類，并提交序列。

3 DGGE技術(shù)在發(fā)酵微生物多樣性研究中的應(yīng)用

3.1 DGGE技術(shù)在發(fā)酵細(xì)菌多樣性研究中的應(yīng)用

Ercolini等[5]（2003）通過(guò)擴(kuò)增V3區(qū)和V4-V5區(qū)的DGGE 發(fā)現(xiàn)英格蘭傳統(tǒng)奶酪Stilton是由植物乳桿菌、卷曲乳桿菌、乳酸乳球菌等復(fù)雜的微生物組成。Cocolin等[6]（2005）應(yīng)用培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法的DGGE分析技術(shù)研究了意大利東北部的3種天然發(fā)酵臘腸中的微生物生態(tài)，發(fā)現(xiàn)臘腸中存在卷曲乳桿菌和沙克乳桿菌。邢德峰等[7]（2005）應(yīng)用DGGE技術(shù)分析了產(chǎn)氫發(fā)酵系統(tǒng)微生物群落動(dòng)態(tài)及種群多樣性。間隔7d 從反應(yīng)器取厭氧活性污泥，獲得污泥微生物群落的16S rDNA 指紋圖譜。梁新樂(lè)等[8]（2008）采用DGGE法研究了泡菜中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，并明確了微生物的種類和組成。韓吉雨等[9]（2009）采用DGGE方法分析了玉米及苜蓿青貯動(dòng)態(tài)發(fā)酵體系中細(xì)菌菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)序列代表乳酸菌（LAB）類細(xì)菌，并以Lactobacillus類最多；其次為L(zhǎng)actococcus和Weissella。陳長(zhǎng)卿等[10]（2012）采用DGGE技術(shù)分析了草菇以廢棉為主要成分的培養(yǎng)料在二次發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化情況，細(xì)菌群落多樣性較為豐富，條帶多樣性隨著發(fā)酵進(jìn)程逐漸降低，而且在不同階段中的優(yōu)勢(shì)條帶及相對(duì)豐度在發(fā)生著動(dòng)態(tài)的變化?；厥湛寺〉?3個(gè)不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢(shì)菌株來(lái)自于Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes3個(gè)菌門的11個(gè)屬，其中19株克隆菌株為耐熱細(xì)菌，在發(fā)酵的高溫及降溫階段，Stenotrophomonas、Comamonas、Sphingobacterium和Sinorhizobium屬細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)類群。

3.2 DGGE技術(shù)在發(fā)酵真菌多樣性研究中的應(yīng)用

相比DGGE技術(shù)在發(fā)酵細(xì)菌多樣性研究中的廣泛應(yīng)用，關(guān)于在真菌中的應(yīng)用研究報(bào)道并不多。Cocolin[11]在2000年建立了一種有效檢測(cè)酵母的DGGE方法，并利用DGGE技術(shù)檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵酒中的酵母，可以鑒定至少4種不同的酵母[12]。Nielsen等運(yùn)用DGGE技術(shù)分析了加納可可發(fā)酵過(guò)程的酵母數(shù)量，在大部分發(fā)酵過(guò)程均檢測(cè)到了漢森酵母、假絲酵母和畢赤酵母的某些種，推測(cè)這些微生物在可可發(fā)酵過(guò)程可能起著重要作用[13]。高秀芝等[14]（2011）以天源醬園生產(chǎn)豆醬為研究對(duì)象，通過(guò)PCR-DGGE 指紋圖譜技術(shù)分析豆醬發(fā)酵過(guò)程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)豆醬發(fā)酵過(guò)程中主要真菌為米曲霉（Aspergillus oryzae，相似率99%） 的近緣種，在豆醬發(fā)酵前期分解原料中蛋白質(zhì)和淀粉。

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作者簡(jiǎn)介：高躍函（1982-），女，吉林樺甸人，長(zhǎng)春建筑學(xué)院助教，研究方向：生物工程。