摘要：采用鼠傷寒沙門氏菌試驗(yàn)（Ａｍｅｓ試驗(yàn)），通過觀察0.2、1.0、5.0、25.0 μg/皿桔霉素處理對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２回復(fù)突變的影響，檢測(cè)紅曲中桔霉素的致突變性。結(jié)果表明，桔霉素受試物組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的２倍，亦未呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果為陰性，紅曲中桔霉素未表現(xiàn)出致突變性。

關(guān)鍵詞：桔霉素；鼠傷寒沙門氏菌試驗(yàn)（Ａｍｅｓ試驗(yàn)）；致突變性

中圖分類號(hào)：Ｑ３１９＋．３３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）08－1658-02

紅曲由紅曲霉菌發(fā)酵而成，被廣泛應(yīng)用于制作食醋、腐乳、食品色素以及中藥等方面。紅曲在我國(guó)已有１ ０００多年的應(yīng)用歷史，尤其是在降血脂物質(zhì)Ｍｏｎａｃｏｌｉｎ K被發(fā)現(xiàn)后，其更是在醫(yī)藥領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［１］。然而在１９９５年，法國(guó)Ｂｌａｎｃ博士證實(shí)了紅曲霉具有產(chǎn)生真菌毒素桔霉素的能力，從而使紅曲產(chǎn)品的安全性受到了質(zhì)疑［２］。

桔霉素是紅曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于中等偏劇毒性毒素［３］，具有腎毒性，能引起試驗(yàn)動(dòng)物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴(kuò)張和上皮細(xì)胞變性壞死等癥狀［４］，并且由于桔霉素具有潛在的致畸性，會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生潛在危害［５］，而在國(guó)外，桔霉素更是被列為食品污染的嚴(yán)格控制指標(biāo)［６］。小鼠的急性毒性試驗(yàn)表明其ＬＤ５０為１１２ ｍｇ／ｋｇ［７］，在此基礎(chǔ)上，采用鼠傷寒沙門氏菌試驗(yàn)（Ａｍｅｓ試驗(yàn)）研究桔霉素的致突變性，為深入研究其遺傳毒性提供科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１原料與試劑桔霉素、葡萄糖－６－磷酸鈉鹽、氧化型輔酶Ⅱ、敵克松、疊氮鈉、２－氨基芴、１，８－二羥基蒽醌、二甲基亞砜均由Ｓｉｇｍａ公司提供，Ｄ－生物素、Ｌ－組氨酸等其他試劑由武漢市伊格生物科技經(jīng)營(yíng)部提供，多氯聯(lián)苯（ＰＣＢ）誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿（肝Ｓ９液）以及ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供。桔霉素用二甲基亞砜配制成2.0、10.0、50.0、250.0 μｇ／ｍＬ桔霉素溶液供試驗(yàn)用。

１．１．２培養(yǎng)基及１０％ Ｓ９混合液①底層培養(yǎng)基：由每４００ ｍＬ １．５％瓊脂培養(yǎng)基中加入８ ｍＬ磷酸鹽貯備液和２０ ｍＬ ０．４ ｇ／ｍＬ葡萄糖溶液在８０ ℃左右混勻制成。②頂層培養(yǎng)基：由每１００ ｍＬ頂層瓊脂［ｍ（瓊脂粉）∶ｍ（ＮａＣｌ）＝６∶５］中加入１０ ｍＬ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的組氨酸－生物素溶液混勻配制而成。③１０％ Ｓ９混合液：每１０ ｍＬ １０％ Ｓ９混合液由６．０ ｍＬ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ （ｐＨ ７．４）磷酸鹽緩沖液、０．２ ｍＬ １．６５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ溶液、０．２ ｍＬ ０．４ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２溶液、１．０ ｍＬ ０．０５ ｍｏｌ／Ｌ 葡萄糖－６－磷酸鈉鹽溶液、１．６ ｍＬ ０．０２５ ｍｏｌ／Ｌ氧化型輔酶－Ⅱ溶液以及１．０ ｍＬ的肝Ｓ９液混勻配制而成。

１．２方法

按照ＧＢ １５１９３．４—２００３，試驗(yàn)菌株選用經(jīng)過鑒定合格的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２，體外活化系統(tǒng)為ＰＣＢ誘導(dǎo)的肝S9液制備的10% Ｓ９混合液。

將桔霉素受試物組桔霉素劑量設(shè)置為０．２、１．０、５．０、２５．０ μｇ／皿。各受試物組平板的配制采用平板摻入法，各在４５ ℃保溫的頂層培養(yǎng)基中加入新鮮增菌液０．１ ｍＬ，2.0、10.0、50.0、250.0 μｇ／ｍＬ桔霉素溶液０．１ ｍＬ，在需要活化時(shí)另加入１０％ Ｓ９混合液０．５ ｍＬ，混勻，迅速倒入底層培養(yǎng)基中，平放固化，每組設(shè)置３個(gè)平行，在３７ ℃下培養(yǎng)４８ ｈ。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組，在不加10% Ｓ９混合液時(shí)，菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１０２選用的陽性物（陽性對(duì)照組中加入的對(duì)照指標(biāo)）為敵克松，ＴＡ１００選用的陽性物為疊氮鈉；在加10% Ｓ９混合液時(shí)，菌株ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００選用的陽性物為２－氨基芴，ＴＡ１０２選用的陽性物為１，８－二羥基蒽醌。

若桔霉素受試物組的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)（空白對(duì)照組）的２倍以上并具有劑量反應(yīng)關(guān)系，則可判定試驗(yàn)結(jié)果為陽性，在相同條件下重復(fù)試驗(yàn)２次；否則則可判定試驗(yàn)結(jié)果為陰性，在相同條件下重復(fù)試驗(yàn)１次。

２結(jié)果與分析

加入10% Ｓ９混合液的試驗(yàn)組就相當(dāng)于動(dòng)物體的消化系統(tǒng)，它可以將加入的受試物代謝，這樣就可以檢測(cè)所加的受試物在代謝過程中有沒有產(chǎn)生致突變的物質(zhì)，而不加10% Ｓ９混合液時(shí)就是檢測(cè)受試物本身是否具有致突變性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組各菌株的回變菌落數(shù)均超過空白對(duì)照組的自發(fā)回變菌落數(shù)的２倍以上，表明各鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株對(duì)受試物桔霉素的檢測(cè)有效；而在加與不加體外活化系統(tǒng)（１０％ Ｓ９混合液）的條件下，各劑量桔霉素受試物組的回變菌落數(shù)均與空白對(duì)照組的自發(fā)回變菌落數(shù)相近，并未超過其２倍，亦無劑量反應(yīng)關(guān)系，表明桔霉素在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，在加與不加１０％ Ｓ９混合液兩種情況下，桔霉素的Ａｍｅｓ試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表示桔霉素未表現(xiàn)出致突變性。各菌株的回變菌落數(shù)見表１。

３小結(jié)與討論

根據(jù)相關(guān)報(bào)道，桔霉素可以致畸、導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，可以誘發(fā)突變，但在試驗(yàn)條件下，受試物組桔霉素濃度為250.0 μｇ／mL，即劑量最高達(dá)到２５.０ μｇ／皿時(shí)，其Ａｍｅｓ試驗(yàn)的結(jié)果表明其未表現(xiàn)出致突變性。而這一試驗(yàn)結(jié)果與Ｍａｒｔｉｎ等［8］的在桔霉素濃度達(dá)到１００ μｇ／ｍＬ時(shí)可引起ＤＮＡ的單鏈損傷的研究結(jié)果不一致，但與Ｓａｂａｔｅｒ－Ｖｉｌａｒ等［９］所研究的桔霉素在低劑量時(shí)未表現(xiàn)出致突變性的結(jié)果相一致。在中國(guó)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)ＱＢ／Ｔ ２８４７—２００７中規(guī)定，功能性紅曲米（粉）中的桔霉素含量（以絕干計(jì)）≤５０ μｇ／ｋｇ，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)ＧＢ/Ｔ ５００９．２２２—２００８中規(guī)定，對(duì)液態(tài)樣品中桔霉素的定量限為５０ μｇ／Ｌ，固態(tài)樣品為１ ｍｇ／ｋｇ。在紅曲的實(shí)際應(yīng)用中必須嚴(yán)格控制桔霉素的含量，避免毒副作用和不良反應(yīng)的發(fā)生，保證紅曲藥用和食用的安全性。

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