摘要：研究了體細(xì)胞制備過程中細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、血清饑餓濃度和饑餓時(shí)間對(duì)體細(xì)胞周期同步化的影響。體細(xì)胞為牛卵巢顆粒細(xì)胞，細(xì)胞用碘化丙啶（PI）染色法，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％的血清饑餓濃度下誘導(dǎo)處理２、３、４和５ ｄ。試驗(yàn)結(jié)果表明，第２、１０和２５代的細(xì)胞在Ｇ０／Ｇ１期的比例沒有差異（Ｐ＞０．０５）。培養(yǎng)液中添加０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ較對(duì)照組（１０％ ＦＣＳ）提高了細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５），０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗(yàn)組獲得了相近的細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期比例（Ｐ ＞ ０．０５）。血清饑餓至第5天的細(xì)胞較第2天的細(xì)胞有高的Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５）。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)至不同代的牛卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)Ｇ０／Ｇ１期的比例沒有影響，血清饑餓和延長血清饑餓的時(shí)間能夠有效誘導(dǎo)體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。

關(guān)鍵詞：牛；顆粒細(xì)胞；血清饑餓；同步化；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)：Ｑ８１３；Ｓ８２３．３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）08－1632-04

自１９９７年克隆綿羊Ｄｏｌｌｙ誕生以來，體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，已在許多動(dòng)物中獲得了成功［１－４］。在體細(xì)胞克隆研究中，供體細(xì)胞的選擇和制備是提高體細(xì)胞克隆效率的關(guān)鍵步驟［５，６］。研究者從供體細(xì)胞的類型、供體來源、培養(yǎng)時(shí)間、核質(zhì)同步化處理方法、培養(yǎng)液組成等方面進(jìn)行了大量研究，以期獲得最好的供體細(xì)胞來提高體細(xì)胞克隆的效率。在體細(xì)胞克隆過程中，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。處于Ｇ０／Ｇ１期的供體細(xì)胞通常被認(rèn)為是理想的進(jìn)行克隆研究的供體細(xì)胞，血清饑餓是誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期階段的主要方法［７－９］。雖然人們嘗試使用不同的血清濃度和不同的血清饑餓時(shí)間來誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期，也取得了不錯(cuò)的試驗(yàn)結(jié)果［１０，１１］，但很少將血清饑餓濃度、饑餓時(shí)間及細(xì)胞傳代階段與細(xì)胞周期的同步化做深入的關(guān)聯(lián)分析研究。該試驗(yàn)研究了牛卵巢顆粒細(xì)胞制備過程中不同的血清濃度、血清饑餓時(shí)間以及體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期同步化的影響。

１材料與方法

１．１材料

黃牛卵巢采自貴陽市某屠宰場；胎牛血清購自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、鏈霉素、DMSO和透明質(zhì)酸購自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100購自南京凱基生物工程有限公司。

１．2牛卵巢顆粒細(xì)胞制備

黃牛卵巢從屠宰場收集后裝入加有１００ ＩＵ/ｍＬ 鏈霉素和１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素的３０℃ 的ＤＰＢＳ中，于４ ｈ內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢帶回實(shí)驗(yàn)室后以ＤＰＢＳ清洗２次，從卵巢表面抽取卵泡液，?。?ｍＬ卵泡液用等量的０．２％透明質(zhì)酸酶消化３ ｍｉｎ，用ＤＭＥＭ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，然后用ＤＭＥＭ調(diào)整顆粒細(xì)胞的密度為１×１０６個(gè)／ｍＬ，將顆粒細(xì)胞移入加體積分?jǐn)?shù)１０％ＦＣＳ、２ ｍmｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００ ＩＵ／ｍL青霉素和鏈霉素的ＤＭＥＭ中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長至８０％～９０％時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞消化用含０．１％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的消化液，在３７．５℃下進(jìn)行。細(xì)胞冷凍保存液是含有２０％（V／V） ＦＣＳ和５％ ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ。顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％ FCS濃度下分別處理２、３、４和５ ｄ以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。

１．3ＰＩ染色法檢測細(xì)胞周期

培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在３７．５ ℃下用０．１％胰蛋白酶和０．０２％ ＥＤＴＡ的消化液消化處理，然后移入５ ｍL離心管中用 ＤＰＢＳ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，再用ＤＰＢＳ調(diào)整細(xì)胞濃度，使每個(gè)離心管中細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到１×１０５個(gè)。細(xì)胞在４ ℃ 條件下加入３ ｍL預(yù)冷的 ７０％ 乙醇進(jìn)行固定，過夜。固定后的細(xì)胞用提前預(yù)冷的ＤＰＢＳ洗滌離心２次，然后在每管中加入含有１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ 的０．５ ｍＬ ＰＢＳ，在３７ ℃的水浴中處理３０ ｍｉｎ。細(xì)胞染色是在４ ℃ 條件下以０．１ ｍｇ／ｍＬ ＰＩ 和０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００避光處理２ ｈ。染色處理結(jié)束的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測其細(xì)胞周期。

１．4試驗(yàn)方法

１．4．１培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響，分別將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導(dǎo)處理２ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．4．２不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓在對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞分別用含０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理２ ｄ，對(duì)照組為１０％ ＦＣＳ。然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同試驗(yàn)處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．4．３血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用含０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測不同處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．5統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ １１．５軟件分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。

２結(jié)果與分析

２．１培養(yǎng)時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導(dǎo)處理２ ｄ，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響見表１。第２、１０和２５代牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的百分比分別為８２．６％、８４．７％和８３．８％，各組之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有０．５％ ＦＣＳ 和０．０５％ ＦＣＳ 的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理２ ｄ，不同濃度的ＦＣＳ對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響見表２。由表2可知，０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗(yàn)組較對(duì)照組顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比（Ｐ＜０．０５），但試驗(yàn)組間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），兩者均獲得了比較高比例的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞，但對(duì)照組（１０％ ＦＣＳ）僅有６２．４％的細(xì)胞處于Ｇ０／Ｇ１期。

２．３血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響見表３。從表3中可以看出，隨著饑餓處理時(shí)間的增加，Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。饑餓處理５ ｄ較２ ｄ顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比（Ｐ＜０．０５），饑餓處理２ ｄ和５ ｄ后的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比分別為８１．２％和８７．６％。

３小結(jié)與討論

體細(xì)胞克隆技術(shù)中供體細(xì)胞的細(xì)胞周期和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。供體細(xì)胞處于Ｇ０／Ｇ１階段有益于供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的核質(zhì)同步化以及重構(gòu)胚的再程序化，而且能夠正常的濃縮染色體，在第一次細(xì)胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)［１２］。在長期的研究中，人們采用了幾種不同的研究方法得到處于Ｇ０／Ｇ１階段的供體細(xì)胞［１３，１４］。在供體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化中，人們常以血清饑餓誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。在牛成纖維細(xì)胞的研究中，通過０．０５％濃度的血清誘導(dǎo)供體細(xì)胞取得了成功，同時(shí)通過延長低濃度血清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的時(shí)間，提高了Ｇ０／Ｇ１階段細(xì)胞的比例［１5］。在當(dāng)前的研究中，０．５％和０．０５％濃度的ＦＣＳ在誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞獲得高比例Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞方面沒有顯著差異，但０．５％和０．０５％的ＦＣＳ較１０％的ＦＣＳ顯著提高了牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例。這表明低濃度的血清誘導(dǎo)可以提高牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期沒有影響。結(jié)合以前的研究報(bào)道和本試驗(yàn)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)并非血清饑餓就可以誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期，這中間除了有不同實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境和操作工藝存在差別的原因外，可能還與細(xì)胞類型及細(xì)胞來源有關(guān)。本研究中，通過延長０．５％濃度ＦＣＳ對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)饑餓處理５ ｄ的牛卵巢顆粒細(xì)胞較處理２ ｄ的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了較高的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞百分比。在對(duì)牛成纖維細(xì)胞的血清饑餓誘導(dǎo)研究中有和本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，研究人員將血清饑餓的時(shí)間延長至１４ ｄ，得到了高比例的Ｇ０／Ｇ１期牛成纖維細(xì)胞［１６］。以前的研究和我們的試驗(yàn)結(jié)果說明通過延長血清饑餓的時(shí)間同樣可以獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期供體細(xì)胞。

在體細(xì)胞克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)Ｄｏｌｌｙ的端粒長度明顯短于同齡羊，而與供體乳腺細(xì)胞的端粒長度相當(dāng)。這就提出了一個(gè)問題，體細(xì)胞克隆動(dòng)物是否會(huì)遺傳供體核縮短了的端粒給后代，從而導(dǎo)致過早衰老。但之后幾年大量的研究表明，端粒復(fù)原存在于大部分克隆動(dòng)物中，端?？s短可能不是造成克隆動(dòng)物高死亡率的最主要原因。但在供體細(xì)胞體外制備過程中，人們又在擔(dān)心體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)給供體細(xì)胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來負(fù)面影響。而且有人認(rèn)為供體細(xì)胞衰老對(duì)重構(gòu)胚的發(fā)育潛能有影響，所以通常選擇體外培養(yǎng)短期階段的體細(xì)胞進(jìn)行克隆［１７］。但大量的研究也表明，體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞在重構(gòu)胚構(gòu)建及重構(gòu)胚發(fā)育方面優(yōu)于短期培養(yǎng)的細(xì)胞［１８］。在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了相近比例的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞。這表明體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞是否衰老對(duì)通過血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞獲得Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例沒有影響。因此，在牛卵巢顆粒細(xì)胞制備用作供體細(xì)胞的研究中，血清饑餓誘導(dǎo)可以提高細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期沒有影響，延長饑餓誘導(dǎo)的時(shí)間可以提高Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例；體外傳代時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞比例的影響不顯著。

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［１８］ ＤＩＮＮＹＥＳ Ａ， ＤＡＩ Ｙ， ＢＡＲＢＥＲ Ｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｒａｂｂｉｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００１，６４ （１）：２５７－２６３．