摘要：研究了體細(xì)胞制備過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、血清饑餓濃度和饑餓時(shí)間對(duì)體細(xì)胞周期同步化的影響。體細(xì)胞為牛卵巢顆粒細(xì)胞，細(xì)胞用碘化丙啶（PI）染色法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％的血清饑餓濃度下誘導(dǎo)處理２、３、４和５ ｄ。試驗(yàn)結(jié)果表明，第２、１０和２５代的細(xì)胞在Ｇ０／Ｇ１期的比例沒(méi)有差異（Ｐ＞０．０５）。培養(yǎng)液中添加０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ較對(duì)照組（１０％ ＦＣＳ）提高了細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５），０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗(yàn)組獲得了相近的細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期比例（Ｐ ＞ ０．０５）。血清饑餓至第5天的細(xì)胞較第2天的細(xì)胞有高的Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５）。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)至不同代的牛卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)Ｇ０／Ｇ１期的比例沒(méi)有影響，血清饑餓和延長(zhǎng)血清饑餓的時(shí)間能夠有效誘導(dǎo)體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。

關(guān)鍵詞：牛；顆粒細(xì)胞；血清饑餓；同步化；細(xì)胞周期

中圖分類號(hào)：Ｑ８１３；Ｓ８２３．３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）08－1632-04

自１９９７年克隆綿羊Ｄｏｌｌｙ誕生以來(lái)，體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，已在許多動(dòng)物中獲得了成功［１－４］。在體細(xì)胞克隆研究中，供體細(xì)胞的選擇和制備是提高體細(xì)胞克隆效率的關(guān)鍵步驟［５，６］。研究者從供體細(xì)胞的類型、供體來(lái)源、培養(yǎng)時(shí)間、核質(zhì)同步化處理方法、培養(yǎng)液組成等方面進(jìn)行了大量研究，以期獲得最好的供體細(xì)胞來(lái)提高體細(xì)胞克隆的效率。在體細(xì)胞克隆過(guò)程中，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。處于Ｇ０／Ｇ１期的供體細(xì)胞通常被認(rèn)為是理想的進(jìn)行克隆研究的供體細(xì)胞，血清饑餓是誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期階段的主要方法［７－９］。雖然人們嘗試使用不同的血清濃度和不同的血清饑餓時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期，也取得了不錯(cuò)的試驗(yàn)結(jié)果［１０，１１］，但很少將血清饑餓濃度、饑餓時(shí)間及細(xì)胞傳代階段與細(xì)胞周期的同步化做深入的關(guān)聯(lián)分析研究。該試驗(yàn)研究了牛卵巢顆粒細(xì)胞制備過(guò)程中不同的血清濃度、血清饑餓時(shí)間以及體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期同步化的影響。

１材料與方法

１．１材料

黃牛卵巢采自貴陽(yáng)市某屠宰場(chǎng)；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、鏈霉素、DMSO和透明質(zhì)酸購(gòu)自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100購(gòu)自南京凱基生物工程有限公司。

１．2牛卵巢顆粒細(xì)胞制備

黃牛卵巢從屠宰場(chǎng)收集后裝入加有１００ ＩＵ/ｍＬ 鏈霉素和１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素的３０℃ 的ＤＰＢＳ中，于４ ｈ內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢帶回實(shí)驗(yàn)室后以ＤＰＢＳ清洗２次，從卵巢表面抽取卵泡液，取２ ｍＬ卵泡液用等量的０．２％透明質(zhì)酸酶消化３ ｍｉｎ，用ＤＭＥＭ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，然后用ＤＭＥＭ調(diào)整顆粒細(xì)胞的密度為１×１０６個(gè)／ｍＬ，將顆粒細(xì)胞移入加體積分?jǐn)?shù)１０％ＦＣＳ、２ ｍmｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００ ＩＵ／ｍL青霉素和鏈霉素的ＤＭＥＭ中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至８０％～９０％時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞消化用含０．１％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的消化液，在３７．５℃下進(jìn)行。細(xì)胞冷凍保存液是含有２０％（V／V） ＦＣＳ和５％ ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ。顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％ FCS濃度下分別處理２、３、４和５ ｄ以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。

１．3ＰＩ染色法檢測(cè)細(xì)胞周期

培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在３７．５ ℃下用０．１％胰蛋白酶和０．０２％ ＥＤＴＡ的消化液消化處理，然后移入５ ｍL離心管中用 ＤＰＢＳ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，再用ＤＰＢＳ調(diào)整細(xì)胞濃度，使每個(gè)離心管中細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到１×１０５個(gè)。細(xì)胞在４ ℃ 條件下加入３ ｍL預(yù)冷的 ７０％ 乙醇進(jìn)行固定，過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用提前預(yù)冷的ＤＰＢＳ洗滌離心２次，然后在每管中加入含有１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ 的０．５ ｍＬ ＰＢＳ，在３７ ℃的水浴中處理３０ ｍｉｎ。細(xì)胞染色是在４ ℃ 條件下以０．１ ｍｇ／ｍＬ ＰＩ 和０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００避光處理２ ｈ。染色處理結(jié)束的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期。

１．4試驗(yàn)方法

１．4．１培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響，分別將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導(dǎo)處理２ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．4．２不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓在對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞分別用含０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理２ ｄ，對(duì)照組為１０％ ＦＣＳ。然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同試驗(yàn)處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．4．３血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用含０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。

１．5統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ １１．５軟件分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

２結(jié)果與分析

２．１培養(yǎng)時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導(dǎo)處理２ ｄ，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響見(jiàn)表１。第２、１０和２５代牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的百分比分別為８２．６％、８４．７％和８３．８％，各組之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有０．５％ ＦＣＳ 和０．０５％ ＦＣＳ 的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理２ ｄ，不同濃度的ＦＣＳ對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響見(jiàn)表２。由表2可知，０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗(yàn)組較對(duì)照組顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比（Ｐ＜０．０５），但試驗(yàn)組間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），兩者均獲得了比較高比例的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞，但對(duì)照組（１０％ ＦＣＳ）僅有６２．４％的細(xì)胞處于Ｇ０／Ｇ１期。

２．３血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期的影響見(jiàn)表３。從表3中可以看出，隨著饑餓處理時(shí)間的增加，Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。饑餓處理５ ｄ較２ ｄ顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比（Ｐ＜０．０５），饑餓處理２ ｄ和５ ｄ后的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的百分比分別為８１．２％和８７．６％。

３小結(jié)與討論

體細(xì)胞克隆技術(shù)中供體細(xì)胞的細(xì)胞周期和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。供體細(xì)胞處于Ｇ０／Ｇ１階段有益于供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的核質(zhì)同步化以及重構(gòu)胚的再程序化，而且能夠正常的濃縮染色體，在第一次細(xì)胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)［１２］。在長(zhǎng)期的研究中，人們采用了幾種不同的研究方法得到處于Ｇ０／Ｇ１階段的供體細(xì)胞［１３，１４］。在供體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化中，人們常以血清饑餓誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期。在牛成纖維細(xì)胞的研究中，通過(guò)０．０５％濃度的血清誘導(dǎo)供體細(xì)胞取得了成功，同時(shí)通過(guò)延長(zhǎng)低濃度血清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的時(shí)間，提高了Ｇ０／Ｇ１階段細(xì)胞的比例［１5］。在當(dāng)前的研究中，０．５％和０．０５％濃度的ＦＣＳ在誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞獲得高比例Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞方面沒(méi)有顯著差異，但０．５％和０．０５％的ＦＣＳ較１０％的ＦＣＳ顯著提高了牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例。這表明低濃度的血清誘導(dǎo)可以提高牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期沒(méi)有影響。結(jié)合以前的研究報(bào)道和本試驗(yàn)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)并非血清饑餓就可以誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期，這中間除了有不同實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境和操作工藝存在差別的原因外，可能還與細(xì)胞類型及細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。本研究中，通過(guò)延長(zhǎng)０．５％濃度ＦＣＳ對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)饑餓處理５ ｄ的牛卵巢顆粒細(xì)胞較處理２ ｄ的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了較高的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞百分比。在對(duì)牛成纖維細(xì)胞的血清饑餓誘導(dǎo)研究中有和本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，研究人員將血清饑餓的時(shí)間延長(zhǎng)至１４ ｄ，得到了高比例的Ｇ０／Ｇ１期牛成纖維細(xì)胞［１６］。以前的研究和我們的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明通過(guò)延長(zhǎng)血清饑餓的時(shí)間同樣可以獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期供體細(xì)胞。

在體細(xì)胞克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)Ｄｏｌｌｙ的端粒長(zhǎng)度明顯短于同齡羊，而與供體乳腺細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度相當(dāng)。這就提出了一個(gè)問(wèn)題，體細(xì)胞克隆動(dòng)物是否會(huì)遺傳供體核縮短了的端粒給后代，從而導(dǎo)致過(guò)早衰老。但之后幾年大量的研究表明，端粒復(fù)原存在于大部分克隆動(dòng)物中，端?？s短可能不是造成克隆動(dòng)物高死亡率的最主要原因。但在供體細(xì)胞體外制備過(guò)程中，人們又在擔(dān)心體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)給供體細(xì)胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來(lái)負(fù)面影響。而且有人認(rèn)為供體細(xì)胞衰老對(duì)重構(gòu)胚的發(fā)育潛能有影響，所以通常選擇體外培養(yǎng)短期階段的體細(xì)胞進(jìn)行克?。郏保罚?。但大量的研究也表明，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞在重構(gòu)胚構(gòu)建及重構(gòu)胚發(fā)育方面優(yōu)于短期培養(yǎng)的細(xì)胞［１８］。在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了相近比例的Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞。這表明體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞是否衰老對(duì)通過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞獲得Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例沒(méi)有影響。因此，在牛卵巢顆粒細(xì)胞制備用作供體細(xì)胞的研究中，血清饑餓誘導(dǎo)可以提高細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入Ｇ０／Ｇ１期沒(méi)有影響，延長(zhǎng)饑餓誘導(dǎo)的時(shí)間可以提高Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞的比例；體外傳代時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞Ｇ０／Ｇ１期細(xì)胞比例的影響不顯著。

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［１５］ ＨＩＬＬ Ｊ Ｒ，ＷＩＮＧＥＲ Ｑ Ａ， ＢＵＲＧＨＡＲＤＴ Ｒ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｂｏｖｉｎｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｆｅｔｕｓ［Ｊ］． Ａｎｉｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，２００１，６７：１７－２６．

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［１７］ ＫＵＨＨＯＬＺＥＲ Ｂ， ＢＡＧＵＩＳＩ Ａ， ＯＶＥＲＳＴＲＯＭ Ｅ Ｗ． Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏａｔ ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， ２０００， ５３：１０７１－１０７９．

［１８］ ＤＩＮＮＹＥＳ Ａ， ＤＡＩ Ｙ， ＢＡＲＢＥＲ Ｍ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｅｍｂｒｙｏｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｒａｂｂｉｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｏｎｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００１，６４ （１）：２５７－２６３．