摘 要：對蓖麻根際菌株LX6的抗菌活性進行了測定。結(jié)果表明，該菌株對多種植物病原真菌具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。其中對三七根腐病菌（Cylindrocarpon destruans）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、玉米彎孢病菌（Curvularia lunata）和禾谷鐮刀病菌（Fusarium graminearum ）的抑菌效果均達50%以上。通過對LX6菌株的形態(tài)特征、染色反應、培養(yǎng)性狀、生理生化特征試驗以及16S rDNA鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞：蓖麻根際菌株LX6；抑菌活性；分子鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號：S154.38+1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0078-03

Determination of Antibacterial Activity and Molecular Identification

of Antagonistic Bacterium LX6 from Castor-oil Rhizosphere

Chi YuCheng1*， Xu ManLin1*， Xie HongFeng1， Yang WeiQiang1， Wang BaoLiang2， Cao TieHua3

（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China；

2. Agricultural Bureau of Jiaonan City， Jiaonan 266400， China；

3.Jilin Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130033， China）

Abstract The antagonistic activity of strain LX6 from castor-oil rhizosphere was determined in this paper. The results showed that LX6 strain had obvious antagonistic activity against many plant pathogenic fungus， especially to Cylindrocarpon destruans， Fusarium oxysporum， Curvularia Lunata and Fusarium graminearum， the antibacterial rate could be over 50%. According to the tests on morphological features， staining reaction， culture traits， physiological and biochemical characteristic and 16S rDNA， it was identified as Bacillus subtilis.

Key words Strain LX6 from castor-oil rhizospher； Antagonistic activity；Molecular identification； Bacillus subtilis

蓖麻種植在全世界30余個國家已經(jīng)達到了工業(yè)化規(guī)模。在印度、中國、巴西、前蘇聯(lián)、泰國、埃塞俄比亞和菲律賓等國的蓖麻產(chǎn)量約占全世界蓖麻總產(chǎn)量的近88%。歷史上，巴西、中國、印度是主要的生產(chǎn)國。蓖麻提取物作為殺蟲劑已有廣泛的應用[1，2]，但對其根際微生物的研究還鮮有報道。

芽孢桿菌是生防細菌中表現(xiàn)較為突出的一種，被引入植物生物防治領(lǐng)域并表現(xiàn)出良好的發(fā)展趨勢，其以控制病害發(fā)生，促進植株生長，提高作物產(chǎn)量以及易于生產(chǎn)和運輸?shù)确矫姹憩F(xiàn)出特有的優(yōu)勢[3～6]。筆者從蓖麻根際土壤中篩選到一株對多種植物病原菌有良好抑制作用的生防細菌LX6，此菌株表現(xiàn)出了廣譜的抗菌活性。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌。

1 材料與方法

11 供試菌株及病原物

供試拮抗菌LX6和供試病原物（表1）均由本實驗室分離保存。

12 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（LB）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）分別用于LX6和真菌的固體培養(yǎng)，相應的培養(yǎng)液用于兩類微生物的液體培養(yǎng)，對峙培養(yǎng)法均在PDA培養(yǎng)基上進行。

13 試驗方法

131 平板對峙培養(yǎng)法測定對蓖麻枯萎病菌的抑制作用 采用平板對峙培養(yǎng)法[7]，在PDA平板中間接入培養(yǎng)3～4天的植物病原真菌，d=5 mm，28℃恒溫培養(yǎng)。1～2天后，挑取已經(jīng)在28℃下培養(yǎng)3～4天的芽孢桿菌菌株菌體分別接種在距離真菌菌落中央2 cm處，使成為一個約d=2 mm的菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，定期檢查抑制效果，測量菌落直徑，計算抑制率。

抑制率（%）=（對照真菌的生長直徑-拮抗菌作用后的真菌生長直徑）/對照真菌的生長直徑×100。

132 細菌鑒定方法 參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對生防菌進行生理生化鑒定：將純化好的菌株接種到LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，24 h后取純化好的菌株涂片，進行革蘭氏染色及運動力檢測。生理生化測定包括氧化酶反應，VP試驗，淀粉水解，明膠液化，吲哚、葡萄糖的利用。

菌株16S rDNA鑒定：提取生防菌菌株的DNA，其提取方法主要參照TIANGEN TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒說明書進行；PCR擴增，參照TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒說明書進行PCR擴增。擴增引物為細菌通用引物，序列如下：正向引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物 1541R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析特性，染色后置于3UVTMTransilluminator（UVP，USA）下，檢測擴增結(jié)果；16S rDNA序列測定與分析，所得擴增片段16S rDNA測序由金斯瑞（南京）有限公司進行序列測定。通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序?qū)y定的序列與GenBank中的序列比較，然后從GenBank中獲得和試驗菌株序列相近種、屬的16S rDNA序列。2 結(jié)果與分析

21 LX6對植物病原真菌的拮抗作用

表1結(jié)果顯示，生防菌株LX6對供試的12種病原菌都有不同程度的抑制作用，其中，對三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米彎孢病菌、禾谷鐮刀病菌均有較強的抑制效果（圖1），抑菌率均達50%以上。由此可見，LX6對植物真菌具有廣譜的抗菌效果。

首先提取生防細菌DNA，以該DNA為模板，16S rDNA通用引物為引物，對16S rDNA片段進行擴增。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為 1 400 bp左右得到一條特異性好的條帶，與預期結(jié)果一致。擴增的片段進行序列測定，將測序的結(jié)果輸入NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序進行比對，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源性最高，達到99%，初步鑒定為枯草芽孢桿菌，結(jié)合生理生化特性做進一步鑒定。

23 LX6菌株的生理生化測定

通過表面形態(tài)觀察，該菌為不規(guī)則形，白色，表面膜狀起皺，革蘭氏染色陽性，結(jié)合其他生理生化指標測定（表2），可以進一步判定菌株LX6為枯草芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌是一類在土壤和植物根際廣泛存在的有益微生物，在植物病害的生防控制中顯現(xiàn)出了非常突出的應用價值，同時這類細菌具有良好的抗逆性， 對人畜無害， 不污染環(huán)境，且產(chǎn)芽孢易于生產(chǎn)和儲存，因而備受植病生防研究者的青睞。目前，已有多種菌株被商品化并廣泛用于鐮刀枯萎病、立枯病和曲霉病等多種植物病害的防治[8]。筆者從蓖麻根際篩選出一株生防菌LX6，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，對供試12種植物病原真菌均有較明顯的抑制作用，尤其對三七根腐病菌、棉花枯萎病菌、玉米彎孢病菌、禾谷鐮刀病菌有較強的抑制效果，抑菌率均達50%以上，顯現(xiàn)出其作為生防菌的顯著優(yōu)勢和良好的應用前景。

枯草芽孢桿菌是一類能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)、具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力的桿狀細菌。目前已從不同來源的菌株中分離到多肽類、脂肽類、細菌素和蛋白質(zhì)等多種類型的抗菌物質(zhì)， 這些抗菌物質(zhì)大多對病原真菌表現(xiàn)出強烈的拮抗活性[9～12]。本研究分離的一株枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出突出的抗菌活性，值得深入研究其作用機理。在今后的工作中將嘗試著分離純化LX6的抑菌物質(zhì)，以期為研究其作用機理、大量獲得抗菌物質(zhì)打下基礎(chǔ)。另一方面也可借助分子生物學手段，根據(jù)GeneBank中公布的Bacillus subtilis的全序列，直接設(shè)計引物克隆抗菌蛋白基因并進行表達，以期大量獲得抗菌蛋白基因，并為下一步構(gòu)建高效生防菌株打下基礎(chǔ)。參 考 文 獻：

[1] 趙建新，張樹懷，佘國珍 蓖麻毒素粗提物殺蟲作用的研究[J]內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報，2001，22（4）：78-80

[2] 徐齊云，胡美英，劉萱清，等蓖麻提取物對蔬菜害蟲的殺蟲活性研究[J]長江蔬菜， 2006，11：35-36

[3] Schmidt C S， Agostini F， Leifert C， et al Influence of soil temperature and matric potential on sugar beet seedling colonization and suppression of pythium damping-off by the antagonistic Bacteria pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis[J] Phytopathology，2004，94（4）：351-363

[4] Cazorla F M， Romero D， Pérez-García A， et al Isolation and characterization of antagonistic Bacillus subtilis strains from the avocado rhizoplane displaying biocontrol activity[J] J Appl Microbiol， 2007，103（5）：1950-1959

[5] Chen H， Xiao X， Wang J， et al Antagonistic effects of volatiles generated by Bacillus subtilis on spore germination and hyphal growth of the plant pathogen， Botrytis cinerea[J] Biotechnol Lett，2008，30（5）：919-923

[6] Lee N K， Yeo I C， Park J W， et al Isolation and characterization of a novel analyte from Bacillus subtilis SC-8 antagonistic to Bacillus cereus[J]JBiosciBioeng，2010， 110（3）：298-303

[7] 方中達植病研究法（第3版）[M]北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998

[8] 陳中義，張 杰，黃大昉 植物病害生防芽孢桿菌抗菌機制與遺傳改良研究[J] 植物病理學報， 2003，33（2）：97-103

[9] Romero D， de Vicente A， Olmos J L， et al Effect of lipopeptides of antagonistic strains of Bacillus subtilis on the morphology and ultrastructure of the cucurbit fungal pathogen Podosphaera fusca[J] J Appl Microbiol， 2007，103（4）：969-976

[10] 連玲麗，謝荔巖，鄭璐平，等 拮抗菌SB1的鑒定及其抗菌物質(zhì)的分析[J] 微生物學通報，2010，37（7）：986-991

[11] Yeo I C， Lee N K， Cha C J，et al Narrow antagonistic activity of antimicrobial peptide from Bacillus subtilis SCK-2 against Bacillus cereus[J] J Biosci Bioeng，2011，112（4）：338-344

[12] 張曉云，李寶慶，郭慶港，等 生防枯草芽孢桿菌CAB-1抑菌蛋白產(chǎn)生條件及其穩(wěn)定性研究[J]中國農(nóng)業(yè)科技導報，2011，13（2）：59-67 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學 2012，44（12）：81～84