摘 要：探索了鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體提取過(guò)程中所需要的酶濃度及其比例、最適甘露醇濃度，以得到最佳鹽地堿蓬原生質(zhì)體的純化方法。結(jié)果表明，原生質(zhì)體分離的最佳條件是：甘露醇0.7 mol/L、纖維素酶3.0%、離析酶1.0%和果膠酶0.2%。

關(guān)鍵詞：鹽地堿蓬；愈傷組織；原生質(zhì)體；分離純化

中圖分類號(hào)：Q949.745.102 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）12-0024-04

Isolation and Purification of Suaeda salsa Protoplast from Callus

Han GuoLiang， Yang JianChao， Sui Na*

（College of Life Science， Shandong Normal University/Shandong Key Laboratory of Plant Stress Research， Jinan 250014， China）

Abstract The optimal enzyme prescription and mannitol concentrations for protoplast extraction from Suaeda salsa callus were tested in this paper， and also the optimum purification method. The results showed that the optimum conditions for protoplast separation were 0.7 mol/L mannitol， 3.0% cellulose， 1.0% macerozyme and 0.2% pectolase.

Key words Suaeda salsa L. ； Callus； Protoplast； Extraction and purification

鹽地堿蓬（Suaeda salsa L.）是典型的稀鹽鹽生植物，主要分布在歐洲和亞洲，我國(guó)東北、西北、華北及沿海各省的鹽堿地均有分布，在海灘以及鹽湖邊形成單優(yōu)群落[1]。鹽地堿蓬是真鹽生植物中一種良好的研究材料，目前其耐鹽的生理機(jī)制研究已經(jīng)取得較大的進(jìn)展，克隆了HKT1、NHX1和 SAM等耐鹽基因，初步揭示了稀鹽鹽生植物在液泡水平離子區(qū)域化提高耐鹽性的機(jī)制[2，3]。由于不清楚鹽地堿蓬的遺傳背景，雖然再生體系已經(jīng)有所突破，但仍然無(wú)法對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的遺傳轉(zhuǎn)化，無(wú)法將這些基因在鹽地堿蓬中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)或者沉默來(lái)更深入研究耐鹽的分子及機(jī)理[4]。將原生質(zhì)體作為遺傳轉(zhuǎn)化體代替常規(guī)的外植體，通過(guò)PEG介導(dǎo)、農(nóng)桿菌培養(yǎng)共轉(zhuǎn)化以及電擊穿孔等轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)化植株[5]，可以為遺傳轉(zhuǎn)化體系建成提供新的思路，目前已經(jīng)在馬鈴薯等高等植物的原生質(zhì)體中獲得轉(zhuǎn)化植株[6]。

成熟的鹽地堿蓬細(xì)胞，中央液泡發(fā)達(dá)，原生質(zhì)體容易破碎，在原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞全能性上不如愈傷組織[7]。植物原生質(zhì)體的純化一般聯(lián)合運(yùn)用過(guò)濾法、離心法和漂浮法，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展，原生質(zhì)體的分離方法越來(lái)越完善。目前以纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶配合的酶解分離法成為最成熟的方案，已經(jīng)在洋蔥、扁蓿豆、沙蔥等植物的愈傷組織中成功提取原生質(zhì)體[8～10]。本研究利用鹽地堿蓬愈傷組織獲得原生質(zhì)體，探索其原生質(zhì)體提取過(guò)程中所需要的各種酶濃度及其比例及最適甘露醇濃度，得到最佳鹽地堿蓬原生質(zhì)體的純化方法，為利用原生質(zhì)體建立遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽地堿蓬種子于2011年11月采自中國(guó)東營(yíng)黃河三角洲自然生境鹽堿地，晾干后去掉果皮儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法及處理

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 鹽地堿蓬種子先用70%（V/V）的乙醇消毒5 min，接著用3.6% NaClO消毒15 min，無(wú)菌水沖洗5～6遍，接種于無(wú)激素的MS培養(yǎng)基上（pH 5.8～6.0），在溫度為（25±2）℃、相對(duì)濕度75%條件下培養(yǎng)10天，獲得無(wú)菌苗[11]。取生長(zhǎng)10天的無(wú)菌苗的下胚軸（直徑約為0.1 cm）剪成長(zhǎng)0.5～1.0 cm的小段，接入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 2， 4-D+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA）暗培養(yǎng)28天后得到白色的愈傷組織[12]，作為酶解的原材料。

1.2.2 原生質(zhì)體的分離 收集鹽地堿蓬愈傷組織，分別放入用磷酸緩沖液（取0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 87.7 ml 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 12.3 ml混合，調(diào)節(jié)pH為6.0）配制的甘露醇濃度分別為0.5、0.7和0.9 mol/L的三種洗滌緩沖液中進(jìn)行質(zhì)壁分離1 h；用刀片將質(zhì)壁分離后的愈傷組織切割；將處理好的愈傷組織和10 ml原生質(zhì)體酶解液（CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、纖維素酶R-10、離析酶R-10、果膠酶Y-23、BSA、DTT、乙二胺四乙酸、甘露醇、蔗糖）放入三角瓶中，于黑暗條件下在臺(tái)式搖床中培養(yǎng)7 h；分別用100目和400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾酶解液到培養(yǎng)皿中，用5 ml洗滌緩沖液（CPW-10）沖洗尼龍網(wǎng)，除去未酶解完全的組織和細(xì)胞團(tuán)；將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到50 ml的離心管中；在光學(xué)顯微鏡下觀察分離到的原生質(zhì)體。

1.2.3 原生質(zhì)體的純化

（1）原生質(zhì)體的純化：過(guò)濾后得到的原生質(zhì)體混合液于150× g離心6 min，沉淀用含0.7 mol/L甘露醇的洗滌緩沖液重懸，重復(fù)離心，沉淀用相同洗滌液重懸即得純化的原生質(zhì)體。過(guò)濾后得到的原生質(zhì)體混合液于500× g離心5 min，使原生質(zhì)體與雜質(zhì)一起沉淀。去上清液后用25%的蔗糖溶液使之懸浮，1 500× g離心5 min，上清液用蒸餾水稀釋3倍，再在500× g離心5 min，沉淀即為純化的原生質(zhì)體。

（2）原生質(zhì)體產(chǎn)量的測(cè)定：采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法計(jì)算原生質(zhì)體的產(chǎn)量。當(dāng)在顯微鏡下（10×25）觀察到大量形態(tài)完整的小球時(shí)，可以判定已經(jīng)分離出了原生質(zhì)體。將純化得到的原生質(zhì)體稀釋后滴加在血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)算5個(gè)大格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)，取平均值，按以下公式計(jì)算原生質(zhì)體相對(duì)得率，原生質(zhì)體相對(duì)得率=血球計(jì)數(shù)板中每個(gè)大格內(nèi)總原生質(zhì)體數(shù)量（個(gè)）/每個(gè)大方格內(nèi)的小方格數(shù)目（265個(gè)）。2 結(jié)果與分析

2.1 鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體的形態(tài)特征

在顯微鏡下可以看到分離到的大小不均的鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體，直徑在10～20 μm之間（圖1）。多數(shù)原生質(zhì)體含有多而小的液泡 （圖1A），但也有的原生質(zhì)體含有大液泡，將細(xì)胞質(zhì)擠到一邊 （圖1B）。

2.2 不同酶解滲透壓的比較

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，0.7、0.9 mol/L甘露醇均可以良好穩(wěn)定原生質(zhì)體，5～7 h為最佳酶解時(shí)間。當(dāng)甘露醇濃度為0.7 mol/L、酶解5 h，原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力都最高，與其他處理差異明顯；分離出的原生質(zhì)體，邊緣清晰，內(nèi)含物多，碎片少。高于或低于這一濃度原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均有所下降，故0.7 mol/L甘露醇、酶解5 h為分離鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體的最佳酶解方案。

2.3 不同酶解配方的比較

表2為纖維素酶濃度固定在3%（W/V）時(shí)離析酶和果膠酶的濃度對(duì)原生質(zhì)體分離的影響，結(jié)果顯示，單獨(dú)使用離析酶或果膠酶很難得到較多的完整原生質(zhì)體，而兩種酶一起使用可以解離出較多的原生質(zhì)體。酶液最佳組合為3%纖維素酶+1%離析酶+0.2%果膠酶。

2.4 不同純化方法的篩選

表3表明，梯度離心的方案不適宜純化愈傷組織原生質(zhì)體，沉淀法存留的雜質(zhì)過(guò)多，未經(jīng)四次過(guò)濾的漂浮法也存在較多的雜質(zhì)，而四次過(guò)濾和漂浮法相結(jié)合能得到最佳的純化效果。

3.1 酶解滲透壓條件

邢道臣等（2003）分離花生的原生質(zhì)體時(shí)，其滲透壓條件為甘露醇0.4 mol/L[14]。王紅霞等（2008）分離蘆薈的原生質(zhì)體時(shí)，其滲透壓條件為甘露醇0.6 mol/L[15]。Gao Zhun等（2007）[16]在做有耐鹽性的胡楊愈傷組織原生質(zhì)體分離時(shí)，用山梨醇來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓，并且以0.75 mol/L的分離效果最佳。

本試驗(yàn)表明，甘露醇濃度為0.7 mol/L是鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體分離的最佳滲透壓條件，這和胡楊愈傷組織原生質(zhì)體分離的最適滲透壓條件相似，但高于花生和蘆薈等，這可能與鹽地堿蓬為鹽生植物，其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞液的濃度較大有關(guān)。

3.2 酶解配方

許智宏等（1983）在做高等植物根的原生質(zhì)體分離時(shí)，使用含2%（W/V）半纖維素酶、4%纖維素酶和0.3%果膠酶的酶解液進(jìn)行酶解[9]。張學(xué)英等（2006）對(duì)草莓原生質(zhì)體分離條件的研究顯示，酶解的最佳酶濃度為1%（W/V）纖維素酶、0.5%離析酶加0.05%果膠酶[17]。涂藝聲等（2009）得到杜鵑屬植物原生質(zhì)體制備的最佳酶解液為2%纖維素酶加1%果膠酶[18]。

由于試驗(yàn)條件的限制，本試驗(yàn)聯(lián)合運(yùn)用纖維素酶、果膠酶和離析酶來(lái)進(jìn)行酶解。結(jié)果表明使用纖維素酶加果膠酶或纖維素酶加離析酶的酶解效果不理想，而同時(shí)使用纖維素酶、果膠酶和離析酶可以達(dá)到較好的效果。在以后的實(shí)驗(yàn)中還可以同時(shí)運(yùn)用纖維素酶、果膠酶、離析酶和半纖維素酶進(jìn)行酶解以達(dá)到更好的結(jié)果。

3.3 鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體的多態(tài)性

楊濤和陳德海（1998）在對(duì)安祖花組織培養(yǎng)及細(xì)胞發(fā)育過(guò)程觀察時(shí)，分別取疏松型和致密型的愈傷組織進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示疏松型愈傷組織的細(xì)胞胞質(zhì)稀薄，液泡大；而致密型愈傷組織細(xì)胞質(zhì)濃，液泡小[19]。張煥玲等（2005）在做栓皮櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)得到胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織。胚性愈傷組織細(xì)胞核大，核仁明顯，核質(zhì)比大，液泡小，染色深；而非胚性愈傷組織核小，核仁不明顯，核質(zhì)比小，液泡大，染色淺[20]。

本試驗(yàn)中得到的愈傷組織原生質(zhì)體具有多態(tài)性，其大小及液泡類型不均一；多數(shù)原生質(zhì)體含有多而小的液泡，但也有的原生質(zhì)體含有大液泡，這可能和愈傷組織的類型以及愈傷組織的發(fā)育過(guò)程不同有關(guān)。

3.4 純化方案

Gao Zhun等（2007）[16]在做胡楊愈傷組織原生質(zhì)體分離的研究時(shí)，運(yùn)用沉淀法進(jìn)行原生質(zhì)體的純化[16]。可能因?yàn)槊附鈼l件不一樣，本實(shí)驗(yàn)使用沉淀法并未得到很好的純化結(jié)果，但是多次過(guò)濾可以去掉大多數(shù)大片段雜質(zhì)，配合漂浮法，可以得到比較純凈的原生質(zhì)體。

綜上所述，本試驗(yàn)初步探討了鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體的分離純化方案，最佳方案是：甘露醇0.7 mol/L、纖維素酶3.0%、離析酶1.0%和果膠酶0.2%。該研究為鹽地堿蓬愈傷組織原生質(zhì)體的培養(yǎng)和遺傳操作提供了可借鑒的試驗(yàn)資料，可以利用愈傷組織懸浮細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系來(lái)完善鹽地堿蓬的遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而對(duì)已克隆的鹽地堿蓬功能性基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。參 考 文 獻(xiàn)：

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