【摘要】本文所選用的實驗材料為小鼠原核胚，主要研究幾種不同溶液、溶液所含不同生長因素、不同培養(yǎng)氣象等所對小鼠原核胚發(fā)展產生的影響，主要目的是最終找到一種適于小鼠胚胎成長的培養(yǎng)環(huán)境以及溶液成分，進而不斷優(yōu)化小鼠胚胎體外培養(yǎng)的體系結構。并且為其它哺乳類動物的胚胎體外培養(yǎng)提供一些參考。

【關鍵詞】小鼠；胚胎；體外培養(yǎng)

0.前言

在邁入新世紀以后，我國的科學技術發(fā)展十分迅猛，尤其是我國的生物科技得到了廣泛的推廣與使用，從而加快了人類社會的發(fā)展。胚胎工程是指主要針對胚胎哺乳類動物的胚胎所進行的工程技術操作，之后再將胚胎繼續(xù)發(fā)育，從而使人們獲得所需的成體動物的一種全新技術。當前，胚胎工程在蓄牧種繁殖預遺傳資源保護、利用方面得到了廣泛推廣和使用，并且在人類疾病真毒、藥物研發(fā)等研究方面蘊含巨大應用價值，因此，受到人們高度的關注。

1.材料預方法

1.1實驗所需的材料

實驗所需的動物：清潔過的雌性預雄性小鼠，所選用的雌性小鼠年齡約在28—35日的日齡范圍內，共約250只，而選用的雄性小鼠日齡在56天以上，共有32只。選用的實際預藥品主要有，丙酮酸鈉、青霉素鈉、鏈霉素、探索氫鈉、氯化鎂、?；撬岬取６x用的儀器主要有倒置顯微鏡與實體顯微鏡，離心機、PH儀、顯微圖像管理系統(tǒng)等。小鼠胚胎培養(yǎng)液主要有三種，即HTF、CZB、KSOM溶液。在配制每一種溶液時都要進行過濾，以便除菌，并且還要放在4攝氏度的環(huán)境下進行保存。

1.2小鼠超數(shù)排卵

從中選用體重超過25g雌性小鼠，要在小鼠腹腔中注射PMSG20IU，待48小時之后再在腹腔中注射Hcg10IU。雄性小鼠要選用體重超過30g的，嚴格按照雌性鼠預雄性鼠比例為2：1的比例放在同一個籠中混合養(yǎng)殖，在第二天早晨要檢查小鼠的陰道栓，將具有陰道栓的雌性小鼠在20—23小時范圍內提取卵母細胞預卵丘細胞的復合體。

1.3采集小鼠的原核胚

在注射hCG后的22小時后，采用頸椎脫臼方法將小鼠處死，在用酒精消毒之后，剪開腹腔，在沿著小鼠卵巢端剪取輸卵管，將輸卵管放在生理鹽水的35mm培養(yǎng)器皿中，然后將培養(yǎng)器皿放進實驗室，將小鼠的輸卵管放入到洗卵液培養(yǎng)器皿中浸泡一段時間。與此同時，要求實驗人員在體視顯微鏡下準確找到輸卵管膨大位置，再使用專門的注射器將其劃破，然后輕輕擠壓小鼠輸卵管端部，從而大量溢出小鼠卵母細胞復合體。

1.4培養(yǎng)小鼠原核胚

首先，要制作一胚胎培養(yǎng)碟，然后將小鼠原核胚放入其中，并且在上部覆蓋一層石蠟油，將其放置在碳培養(yǎng)箱中，調節(jié)至37度環(huán)境下預熱四個小時。把細胞復合體取出放在500uLHTF溶液中，利用移液槍吹打幾次，并將脫光卵丘細胞原核胚抽取出。多次反復進行此操作，待卵細胞全部脫落后，再將其移動到胚胎培養(yǎng)碟中培養(yǎng)。在移入時標記為0小時，在24小時以后，便開始觀察小鼠卵細胞的分裂情況，而在48小時之后便開始觀察小鼠細胞分裂情況，在72小時后觀察小鼠桑椹胚分裂，在96小時后觀察小鼠囊胚分裂輕，而在120小時之后，便開始觀察小鼠囊胚孵化情況。

1.5實驗設計方案

實驗1不同培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原核胚體，將正常受精之后的小鼠原核胚分為3小組，并且分別放入到三種不同培養(yǎng)基中，即HTF、CZB、KSOM中，共培養(yǎng)約120小時。并且要不斷觀察小鼠原核胚發(fā)育狀況，對三組胚胎發(fā)育率加以統(tǒng)計，此次實驗要進行多次。

實驗2置于不同濃度的EGF或者是bFGF的KSOM溶液培養(yǎng)小鼠原核胚體將受精后的正常原核胚分成7組，分別在含有EGF以及bFGF的KOSM溶液中培養(yǎng)120小時。并且要不斷觀察小鼠的原核胚發(fā)育狀況，再將各組培養(yǎng)基中小鼠胚胎發(fā)育率加以統(tǒng)計。此實驗重復進行幾次。

實驗3利用WOW法培養(yǎng)小鼠原核胚，在受精后的原核胚分成2組，利用WOW法以及成組培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠原核胚胎。在培養(yǎng)約120小時左右，觀察其原核胚發(fā)育情況，統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育率，此實驗重復進行多次。

實驗4將小鼠原核胚體放在不同培養(yǎng)氣相中培養(yǎng)，將受精后的原核胚分成3組，分別放在不同的混合氣體中培養(yǎng)約120小時。觀察小鼠原核胚體發(fā)育狀況，統(tǒng)計各組胚胎發(fā)育率。此實驗重復進行多次。

2.結果分析

2.1三組溶液對小鼠原核胚體發(fā)育產生的影響

通過實驗我們得出：在這三組溶液中，其卵裂率、囊胚率、囊胚細胞并沒有較大差異。其中，在KOMS溶液中的卵裂率是最大的，而CZB溶液中囊胚率比其它兩種溶液要高，然而，HTF囊胚細胞數(shù)是最多的。

2.2 KSOM中EGF或者bFGF含量不同對小鼠原核胚體發(fā)育產生的影響

在培養(yǎng)基中，加入不同溶度的EGF或者是BFGF，并不會對小鼠原核胚發(fā)育產生較大的影響。

2.3 WOW對小鼠原核胚體發(fā)生產生的影響

實驗結果表明：從卵裂率方面來分析，WOW要高于對照組，但是，效果不是十分明顯；從小鼠受精細胞的囊胚率、囊細胞數(shù)角度分析，利用WOW法分裂能力要明顯高于對照組。因此，便得出培養(yǎng)小鼠原核胚應該最好利用WOW法，其培養(yǎng)效果較好。

2.4培育氣相不同對小鼠原核胚胎發(fā)育產生的影響

通過實驗證明，在氧氣濃度為5%的KSOM培養(yǎng)液與在肺氣組CZB溶液中的的培養(yǎng)效果最好。

3.討論

3.1不同溶液對小鼠原核胚體發(fā)育影響

對于哺乳類動物胚體的發(fā)育來說，是受很多因素影響的，但是，最主要的影響因素是培養(yǎng)基。然而，當前，哺乳類動物胚體體外發(fā)育往往會選用集中溶液包含HTF、CZB、KSOM等。雖然其它類型的胚胎培養(yǎng)液也可以支持哺乳動物胚胎的體外發(fā)育。然而，在體外培育胚胎過程中，常表現(xiàn)出一定程度的發(fā)育阻滯。在通過大量實驗證明，HTF培養(yǎng)效果最好。

3.2不同濃度EGF或者是BFGF對小鼠胚體發(fā)育帶來的影響

通過實驗證明，小鼠的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，因小鼠胚體原性生長因素在胚體發(fā)育中有較強的分泌調控能力，能夠快速使胚體發(fā)育至囊胚時期。然而，只依靠內源性生長因素，會導致胚胎發(fā)育非常緩慢，并且囊胚的發(fā)育率偏低，最終導致囊胚細胞較少。因此，胚胎發(fā)育需要來自怒踢生殖管道分泌的生長因子的共同參與。但是，如果不具有外源性生長因素，那么會嚴重阻礙小鼠胚胎發(fā)育。

3.3培養(yǎng)方法不同對小鼠胚體發(fā)育產生的影響

在體外培養(yǎng)胚胎時，采用微滴方式可以促進胚胎的發(fā)育，但是，在選用WOW法培養(yǎng)胚胎時，因胚胎間相互隔離，能夠使胚胎分泌的因子不被稀釋，通過自分泌的方式作用在胚胎上，與此同時，又可以阻礙有毒物質作用在胚胎上，阻礙其發(fā)育率。

3.4培養(yǎng)氣相不同對小鼠胚體發(fā)育產生的影響

通過上述實驗證明，在氧氣濃度為5%的條件下，KOSM培養(yǎng)溶液效果要高度其它幾組，但是，其它兩組培養(yǎng)效果沒有較大差異。雖然小鼠胚體能夠在高濃度的氧氣環(huán)境中生長預發(fā)育，然而，在低濃度氧氣環(huán)境下，能夠提高胚胎的存活率，更會促進胚胎的發(fā)育。

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