摘 要： 本研究望能為其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。研究方法如下：利用搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，用殼聚糖進(jìn)行固定化。結(jié)果是粗酶液被純化，以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化酶，得出結(jié)論：褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經(jīng)硫酸銨鹽析、2次SephadexG-100柱純化，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15 IU/mg，以戊二醛為交聯(lián)劑制備固定化酶。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性很強(qiáng)，而固定化酶的熱穩(wěn)定性比原酶強(qiáng)；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min。
　　關(guān)鍵詞： 褐色高溫單孢菌 纖維素酶 固定化
　　一、前言
　　在化工資源貯藏量不斷減少的今天，通過可再生纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡萄糖和乙醇已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1]-[2]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是把纖維素類物質(zhì)酶法水解成葡萄糖。迄今為止，已有很多關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究報(bào)道[3]-[4]，但其中多數(shù)以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等為研究對(duì)象。由細(xì)菌、放線菌所產(chǎn)生的中性纖維素酶和堿性纖維素酶，在洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用已引起人們的高度重視[5]-[6]。有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）產(chǎn)纖維素酶的性質(zhì)，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但對(duì)該酶的固定化未見有報(bào)道。本研究對(duì)發(fā)酵的粗酶液進(jìn)行了純化，再制備成固定化酶，然后對(duì)其最適反應(yīng)溫度、pH值、耐熱性及米氏常數(shù)等進(jìn)行了研究，望能為其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
　　二、材料和方法
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　　（1）菌種
　　褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。
　　（2）試劑
　　分離介質(zhì)SephadexG-100（德國(guó)Phamacia）；羧甲基纖維素鈉（美國(guó)Sigma）；牛血清白蛋白為進(jìn)口分裝；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。
　　（3）儀器
　　高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；紫外可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；核酸蛋白檢測(cè)儀、梯度儀、恒流泵、自動(dòng)部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）等。
　　（4）搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基
　　在Hagerdal Medium[3]中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的微晶纖維素作為碳源。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　（1）蛋白質(zhì)含量測(cè)定
　　采用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　?。?）SDS-PAGE[10]
　　采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，用0.25%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250染色。
　?。?）殼聚糖的制備[11]-[12]
　　將蝦皮洗凈，然后去掉殘余的蝦肉，用3～4倍量體積的4%的稀鹽酸和10%的NaOH反復(fù)處理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色幾丁質(zhì)加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保溫處理6～7h后，再水洗至中性，曬干粉碎，過40目篩即得。
　?。?）粗酶的制備[8]
　　在裝有100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500mL三角瓶中接入10ml種子液，于55℃、200r/min下培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)液以4000r/min的速度離心20min，所得上清液即為粗酶液。
　?。?）粗酶液的純化
　?、倭蛩徜@沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸銨至30%飽和度，在4℃，10000r/min下離心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸緩沖液中，透析除鹽，制得經(jīng)硫酸銨沉淀的純化酶液。
　?、谄暇厶悄z層析。葡聚糖凝膠SephadexG-100經(jīng)充分溶脹后上柱，柱子經(jīng)0.10mol/L的pH6.0的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，每6min收集一管，分別測(cè)定各管的纖維素酶活。
　?。?）纖維素酶的固定化[13]-[14]
　　取一定量的殼聚糖于6%的戊二醛中攪拌2.5h，4℃過夜，然后洗去殘余的戊二醛，在交聯(lián)后的殼聚糖中加入纖維素酶液，室溫下攪拌2.0h，于4℃靜置過夜，再洗去游離酶，即得固定化酶。
　　（7）纖維素酶（CMCase）活力的測(cè)定及定義[15]
　　酶活力的測(cè)定以羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）作底物，經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，然后用DNS（二硝基水楊酸）法測(cè)定還原糖的含量，由還原糖的量來(lái)求得酶活力的大小。
　　取0.5ml適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反應(yīng)30min，取出加入3mlDNS顯色液，然后煮沸5min，停止反應(yīng)，冷卻，于分光光度計(jì)上530nm處比色（空白試驗(yàn)中除酶液事先滅活外，其余條件不變）。
　　一個(gè)酶活單位被定義為在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1μmol還原糖（按葡萄糖計(jì)）所需的酶量。
　?。?）固定化酶的動(dòng)力學(xué)
　　分別在不同的pH及溫度下，測(cè)定其對(duì)酶反應(yīng)速度的影響，并在不同的底物濃度下測(cè)定固定化酶的米氏常數(shù)K和V。
　　三、結(jié)果
　　1.硫酸銨沉淀
　　發(fā)酵粗酶液經(jīng)離心去除菌體和殘?jiān)螅谄渖锨逡褐芯徛尤肓蛩徜@至30%的飽和度，4℃過夜，離心、去除雜蛋白。于上清液中緩慢補(bǔ)加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過夜，離心收集沉淀，沉淀物溶于檸檬酸緩沖液中。透析檢查無(wú)銨離子后，計(jì)算其收率為65.73%。
　　2.第一次SephadexG-100柱層析
　　經(jīng)硫酸銨鹽析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同樣的緩沖液洗脫，洗脫曲線為三個(gè)峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），經(jīng)檢測(cè)主要的纖維素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE結(jié)果表明還有雜蛋白存在，其純化倍數(shù)為30.87，結(jié)果見表1。
　　3.第二次SephadexG-100柱層析
　　將第一次洗脫峰Ⅲ合并，進(jìn)行第二輪SephadexG-100柱層析，纖維素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE結(jié)果表明酶的純度很高。將具有纖維素酶活的峰Ⅲ合并，測(cè)定每一步純化操作中的蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，經(jīng)過SephadexG-100柱純化后，酶的比活力為54.15IU/mg，提純倍數(shù)為47.50。
　　4.不同酶量對(duì)固定化酶活力的影響
　　取7份1.5g殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)物，分別加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后測(cè)定其酶活力，結(jié)果見圖1。
　　5.固定化纖維素酶的最適pH
　　取一定量的固定化酶，分別在pH為5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下測(cè)定其酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在pH為8.5時(shí)，酶的活力最高，如圖2所示。
　　6.固定化纖維素酶的最適溫度
　　取一定量的固定化酶，分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下測(cè)定其酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在溫度為70℃時(shí)，酶的活力最高。
　　7.固定化纖維素酶的耐熱性實(shí)驗(yàn)
　　取10份固定化酶和原酶，分別置于70℃的水浴中，每間隔10min取出一管，按上述方法測(cè)定其酶活力，連續(xù)進(jìn)行100min，結(jié)果如圖4所示。
　　8.固定化酶的米氏常數(shù)
　　用等量的固定化酶與不同的底物濃度于65℃下反應(yīng)15min，測(cè)定其吸收值，用雙倒數(shù)作圖法作圖，測(cè)定酶的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度，結(jié)果見表2。由雙倒數(shù)作圖可知，以CMC-Na為底物，固定化纖維素酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min，而原酶液的Km為7.27mg/ml。
　　四、討論
　　圖1結(jié)果表明，隨著加入酶量的增加，其酶活力隨著增大，但當(dāng)加入的酶量增加到一定程度時(shí)，酶活力增加變得緩慢，這可能是由于在酶的固定化過程中，一定量交聯(lián)后的載體，其活性基團(tuán)是一定的，結(jié)合位點(diǎn)未被飽和之前，固定化酶的活力會(huì)隨加入酶量的增加而增大，一旦結(jié)合位點(diǎn)被飽和后，再增加加入的酶量卻不能增加酶活力。
　　如圖2所示，原酶的最適pH值為9.0，可能由于殼聚糖是陽(yáng)離子型載體，因而固定化酶的最適pH值比原酶要低。
　　如圖3所示，而且固定化酶的熱穩(wěn)定性較原酶高，在60℃～80℃時(shí)酶活力都較高。這表明纖維素酶經(jīng)固定化后，對(duì)熱的穩(wěn)定性明顯提高。
　　圖4的結(jié)果表明，褐色高溫單孢菌纖維素酶的耐熱性很強(qiáng)，保溫100min后，固定化酶的酶活基本保持不變，而且固定化酶比原酶具有較高的熱穩(wěn)定性，由此可以看出，固定化酶的適應(yīng)性更強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等各個(gè)方面。
　　表2結(jié)果表明該纖維素酶在固定化后，其米氏常數(shù)略有減小，說(shuō)明纖維素酶經(jīng)固定化后，與底物的親和力有所增加。
　　五、結(jié)語(yǔ)
　　褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經(jīng)硫酸銨鹽析和SephadexG-100柱純化后，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15IU/mg。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性強(qiáng)，而固定化酶的熱穩(wěn)定性比原酶強(qiáng)；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的K為7.19mg/ml，V為0.132mg/ml·min。
　　有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211固定化纖維素酶在解決能源危機(jī)及可再生資源利用等方面有待進(jìn)一步研究。
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