曾琳玲，楊 威

（1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥健康學(xué)院，廣東 廣州510663；2.廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所，廣東 廣州510240）

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性的骨骼疾病，是目前危害中老年人群身心健康的重要疾病之一。去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型是較常用的動(dòng)物模型之一，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)多采用3～6月齡的雌性大鼠去卵巢模型，較適用于模擬婦女絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。而用雄性及12月齡大鼠建立去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型，可分別模擬男性及老年性的骨質(zhì)疏松，而該模型相關(guān)報(bào)導(dǎo)較少［1］。本實(shí)驗(yàn)分別選用7月齡和12月齡的雌雄大鼠建立去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型，從骨生物力學(xué)、骨組織計(jì)量學(xué)、骨指數(shù)、血清生化等方面綜合評(píng)價(jià)并比較上述骨質(zhì)疏松模型的差異。

1 材料和方法

1.1 材料

動(dòng)物：7月齡、12月齡SPF 級(jí)SD 大鼠，合格證號(hào)分別為：0032537，0034413，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。YLS－16A 小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn)。全自動(dòng)生化分析儀：7020，日本日立公司。病理圖像分析軟件：Image－Pro Plus 6.0，Media Cybemetics公司。

1.2 方 法［2］［3］

7、12月齡雌雄SD 大鼠分別按體重隨機(jī)分為：雌雄偽手 術(shù)組（7Sham－F、7Sham－M和12Sham－F、12Sham－M），雌雄去勢(shì)組（7GONA－F、7GONA－M 和12GONA－F、12GONAM），用2%戊巴比妥鈉麻醉＋＋＋制備血清。血清用于測(cè)定血清鈣（Ca）、磷（P）、堿性磷酸酶（ALP）。大鼠右側(cè)股骨用于測(cè)定骨長(zhǎng)度、最大及最小直徑、骨體積、骨表觀密度（用阿基米德定律測(cè)定）、骨濕重、骨干重（濕骨標(biāo)本于80℃干燥24h所得）、骨灰重（干骨標(biāo)本于馬弗爐650℃灰化24h 所得）；左側(cè)股骨、脛骨用于生物力學(xué)測(cè)定；左側(cè)脛骨近端行脫鈣法制片并使用病理圖像分析軟件測(cè)定以下骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)：骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（%Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均輸入EXCEL2003統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)處理，各組計(jì)量數(shù)據(jù)均采用（±s）表示，結(jié)果進(jìn)行組間t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 去勢(shì)對(duì)大鼠體重的影響

結(jié)果（見(jiàn)表1）表明：與偽手術(shù)組相比，7月齡雌性大鼠去勢(shì)3周后體重增長(zhǎng)明顯加快（P＜0.05或0.01），雄性大鼠去勢(shì)后6周體重增長(zhǎng)明顯減緩（P＜0.05），12月齡去勢(shì)組體重增長(zhǎng)與偽手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 大鼠體重的變化 （±s）

表1 大鼠體重的變化 （±s）

注：與偽手術(shù)組相比，＊表示P＜0.05，＊＊ 表示P＜0.01。

組別 n 動(dòng)物體重（g）去勢(shì)前3wk 6wk 9wk 12wk 15wk 7Sham－F 12 351.6±18.6 358.4±17.9 381.3±23.6 394.4±20.4 409.3±27.2 415.3±47.1 7GONA－F 12 348.8±22.9 387.3±24.1＊＊ 410.3±24.1＊＊ 431.0±29.5＊＊ 450.3±27.3＊＊ 473.2±27.7＊＊7Sham－M 12 542.0±36.1 580.9±37.5 622.4±41.7 643.3±39.4 658.8±38.3 682.8±38.6 7GONA－M 12 546.8±29.8 554.4±29.6 576.4±32.4＊＊ 593.5±31.6＊＊ 604.0±33.1＊ 618.6±32.3＊12Sham－F 10 385.4±43.9 407.2±35.9 412.9±50.9 421.2±51.5 441.2±65.7 457.8±70.2 12GONA－F 8 407.3±49.6 413.4±24.9 435.1±41.2 437.8±41.2 467.5±50.2 475.4±50.0 12Sham－M 9 660.3±70.0 690.8±70.7 705.0±70.2 727.0±77.3 730.4±81.1 750.2±92.8 12GONA－M 9 613.2±45.6 630.1±45.4＊＊ 656.1±52.7 663.8±58.8 672.0±71.0 690.6±67.2

2.2 對(duì)大鼠生物力學(xué)指標(biāo)影響

結(jié)果（見(jiàn)表2）表明：與偽手術(shù)組相比，除12GONA－F組外，其余去勢(shì)組股骨、脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大荷載均明顯減少（P＜0.01）；與7月齡相應(yīng)組相比，12月齡大鼠股骨、脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大荷載無(wú)明顯改變（P＞0.05）；與雌性相應(yīng)組相比，雄性各組大鼠股骨、脛骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)最大荷載均明顯增加（P＜0.01）。

2.3 對(duì)大鼠組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

結(jié)果（見(jiàn)表3）表明：與偽手術(shù)組相比，各去勢(shì)組脛骨近端%Tb.Ar、Tb.N 均減少（P＜0.01），Tb.Sp均增加（P＜0.01或0.05）。與7Sham－F 組相比，7Sham－M、12Sham－F脛骨近端%Tb.Ar、Tb.N 減少（P＜0.01），Tb.Sp增加（P＜0.01）。

2.4 對(duì)大鼠血清生化的影響

結(jié)果（見(jiàn)表4）表明：與7Sham－F組相比，7GONA－F組、12Sham－F ALP明顯升高（P＜0.01）。7GONA－F組血清鈣明顯降低（P＜0.01）。與7Sham－M 組相比，7GONA－M 組ALP明顯降低，血清鈣明顯降低（P＜0.01）。12月齡大鼠去勢(shì)后有雌性ALP 增加而雄性ALP 減少的趨勢(shì)（P＞0.05）。

表2 對(duì)股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷的影響 （±s）

表2 對(duì)股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷的影響 （±s）

注：與偽手術(shù)組相比，＊表示P＜0.05，＊＊表示P＜0.01；與雌性相應(yīng)組相比，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與7月齡相應(yīng)組相比，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01。下同。

組別 n 股骨最大載荷（kg） 脛骨最大載荷（kg）7Sham－F 12 19.804±2.304 12.521±2.575 7GONA－F 12 16.335±1.523＊＊ 8.911±12.832＊7Sham－M 12 25.660±1.183△△ 19.116±2.565△△7GONA－M 12 22.228±1.755＊＊△△14.700±1.908＊＊△△12Sham－F 10 18.812±2.242 11.180±0.814 12GONA－F 8 17.387±0.713 11.438±0.930 12Sham－M 9 26.535±2.077△△ 18.035±1.855△△12GONA－M 9 21.469±3.882＊＊△△14.179±2.334＊＊

表3 對(duì)脛骨近端組織計(jì)量學(xué)的影響 （±s）

表3 對(duì)脛骨近端組織計(jì)量學(xué)的影響 （±s）

組別 n 骨小梁面積百分比（%） 骨小梁厚度（μm） 骨小梁數(shù)目（個(gè)／mm2） 骨小梁分離度（μm）7Sham－F 12 37.16±8.11 52.89±8.23 7.03±1.13 93.31±27.43 7GONA－F 12 16.22±5.39＊＊ 44.63±6.71＊ 3.65±1.06＊＊ 251.73±80.02＊＊7Sham－M 12 22.46±5.77△△ 52.87±10.09 4.24±0.77△△ 192.04±44.34△△7GONA－M 12 15.20±6.01＊＊ 50.92±7.12△ 2.90±0.93＊＊ 347.28±179.36＊＊12Sham－F 10 22.49±4.13▲▲ 57.05±10.84 3.98±0.60▲▲ 199.91±37.42▲▲12GONA－F 8 13.26±4.55＊＊ 52.48±9.17 2.48±0.69＊＊▲▲ 398.13±199.37＊12Sham－M 9 18.54±4.29 59.07±8.81 3.15±0.65△▲▲ 270.45±61.97△▲▲12GONA－M 9 11.28±3.96＊＊ 52.12±9.94 2.10±0.48＊＊▲ 472.24±170.23＊＊

表4 對(duì)大鼠血清生化的影響 （±s）

表4 對(duì)大鼠血清生化的影響 （±s）

組別 n ALP（U／L） Ca（mmol／L） IP（mmol／L）7Sham－F 12 19±11 2.50±0.09 1.66±0.32 7GONA－F 12 34±12＊＊ 2.37±0.13＊＊ 1.53±0.24 7Sham－M 12 51±16△△ 2.30±0.11△△ 2.29±0.78△7GONA－M 12 35±11＊ 1.83±0.42＊＊△△ 1.47±0.44＊＊12Sham－F 10 31±13▲ 2.46±0.16 1.28±0.29▲▲12GONA－F 8 41±17 2.32±0.15 1.31±0.17▲12Sham－M 9 56±14△△ 2.29±0.16△ 1.70±0.11△△▲12GONA－M 9 47±11▲ 2.25±0.09▲▲ 1.47±0.20＊

2.5 對(duì)大鼠右側(cè)股骨骨指數(shù)的影響

結(jié)果（見(jiàn)表5、表6）表明：與7Sham－F組相比，7GONAF組骨最大直徑、濕重、干重、灰重及表觀骨密度均明顯減少（P＜0.05）；與7Sham－M 組相比，7GONA－M 組骨長(zhǎng)度、最大直徑、濕重均明顯減少（P＜0.01或0.05）；與12Sham－M組相比，12GONA－M 組骨長(zhǎng)度、最小直徑、體積、濕重、干重、灰重均明顯減少（P＜0.01 或0.05）；而12Sham－F 與12GONA－F組各項(xiàng)骨指數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與雌性組相比，各相應(yīng)雄性組的骨長(zhǎng)度、最大直徑、最小直徑、體積、濕重、干重、灰重均明顯增加（P＜0.01或0.05）；與12Sham－F相比，12Sham－M 骨表觀骨密度明顯增加（P＜0.01）。與7月齡組相比，12月齡雌性組表觀骨密度減少（P＜0.01）。

表5 對(duì)大鼠右側(cè)股骨骨長(zhǎng)度、直徑的影響 （±s）

表5 對(duì)大鼠右側(cè)股骨骨長(zhǎng)度、直徑的影響 （±s）

組別 n 骨長(zhǎng)度（cm） 骨最大直徑（cm） 骨最小直徑（cm） 骨體積（ml）7Sham－F 12 3.807±0.140 0.592±0.029 0.328±0.020 0.701±0.057 7GONA－F 12 3.772±0.074 0.561±0.024＊ 0.327±0.019 0.666±0.064 7Sham－M 12 4.382±0.103△△ 0.728±0.048△△ 0.387±0.017△△ 1.0433±0.0584△△7GONA－M 12 4.245±0.081＊＊△△ 0.687±0.041＊△△ 0.372±0.026△△ 0.9683±0.1210△△12Sham－F 10 3.851±0.130 0.539±0.085 0.320±0.016 0.74±0.10 12GONA－F 8 3.911±0.104▲▲ 0.496±0.060▲ 0.317±0.019 0.77±0.07▲▲12Sham－M 9 4.463±0.114△△ 0.715±0.075△△ 0.410±0.033△△ 1.15±0.11△△▲12GONA－M 9 4.350±0.076＊△△▲▲ 0.645±0.090△△ 0.368±0.022＊＊△△ 1.00±0.06＊＊△△

表6 對(duì)大鼠右側(cè)股骨濕重、干重、灰重的影響 （±s）

表6 對(duì)大鼠右側(cè)股骨濕重、干重、灰重的影響 （±s）

組別 n 骨濕重（g） 骨干重（g） 骨灰重（g） 骨表觀密度（g／cm3）7Sham－F 12 1.0817±0.1271 0.8198±0.0934 0.5486±0.0708 1.54±0.08 7GONA－F 12 0.9699±0.0911＊ 0.7402±0.0837＊△ 0.4688±0.0720＊ 1.46±0.07＊7Sham－M 12 1.5829±0.1259△△ 1.1363±0.0792△△ 0.7302±0.0598△△ 1.52±0.07 7GONA－M 12 1.4302±0.1680＊△△ 0.9813±0.1523△ 0.6144±0.0884△△ 1.48±0.07 12Sham－F 10 1.0279±0.1240 0.7825±0.0899 0.4792±0.0562 1.40±0.08▲▲12GONA－F 8 1.0271±0.0784 0.7663±0.0575 0.4715±0.0373 1.33±0.06▲▲12Sham－M 9 1.7539±0.1578△△▲ 1.3250±0.1162△△▲▲ 0.8072±0.1038△△ 1.53±0.05△△12GONA－M 9 1.5112±0.1374＊＊△△ 1.1170±0.0818＊＊△△▲ 0.6941±0.0623＊△△▲ 1.51±0.10△△

3 討論

原發(fā)性骨質(zhì)疏松是中老年人較常見(jiàn)的病癥，其包括婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松及老年性骨質(zhì)疏松。手術(shù)摘除大鼠雙側(cè)卵巢的方法能較好地模擬婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，而雄性大鼠去勢(shì)術(shù)是模擬男性骨質(zhì)疏松的簡(jiǎn)便可行的動(dòng)物模型。本試驗(yàn)用7月齡及12月齡的雌雄大鼠分別建立上述骨質(zhì)疏松模型。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：7月齡雌性大鼠去卵巢后體重增長(zhǎng)加快，這可能與雌激素缺乏，活動(dòng)減少，能量消耗小而進(jìn)食未減和脂代謝紊亂有關(guān)。相反地，雄性大鼠去睪丸后則表現(xiàn)為體重增長(zhǎng)減緩，推測(cè)是去勢(shì)后雄性激素減少，從而蛋白質(zhì)合成減少和氨基酸分解的作用增加而使肌肉減少導(dǎo)致體重增長(zhǎng)減緩。但12月齡的雌雄大鼠去勢(shì)后上述趨勢(shì)并不明顯，可能與老齡鼠自身性激素水平低因而去勢(shì)后變化不明顯有關(guān)。

由脛骨近端骨松質(zhì)組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)可見(jiàn)，7、12月齡的雌雄大鼠去勢(shì)后脛骨上段松質(zhì)骨的骨量明顯丟失，呈現(xiàn)典型骨質(zhì)疏松狀態(tài)。增齡亦能引起大鼠骨松質(zhì)骨量的減少，其中雌鼠出現(xiàn)增齡性的骨質(zhì)疏松表現(xiàn)得更為明顯。另外，筆者還發(fā)現(xiàn)，僅從脛骨近端骨松質(zhì)組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)看，雄性偽手術(shù)組的骨量低于雌性偽手術(shù)組，其中7月齡大鼠表現(xiàn)更為明顯。

由生物力學(xué)試驗(yàn)可見(jiàn)，7月齡雌雄大鼠及12月齡雄性大鼠去勢(shì)后其力學(xué)性能均明顯降低，能形成明顯的骨質(zhì)疏松。此外，與7月齡大鼠相比，12月齡大鼠力學(xué)性能未見(jiàn)明顯改變。雄性大鼠的力學(xué)性能明顯優(yōu)于雌性大鼠，這與組織計(jì)量學(xué)所得結(jié)論相反，其原因值得進(jìn)一步研究與探索。

實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)，7月齡雌雄大鼠及12月齡雄性大鼠去勢(shì)后其股骨長(zhǎng)度、直徑、體積、骨重量及骨表觀密度均有不同程度的降低，這與力學(xué)性能的變化較為一致。雄性大鼠骨長(zhǎng)度、直徑、體積、骨重量均明顯大于同齡的雌性動(dòng)物，與7月齡組相比，12月齡雌性大鼠骨表觀密度明顯降低，說(shuō)明雌性大鼠的增齡性骨質(zhì)疏松比雄性更明顯。

由血清生化指標(biāo)可見(jiàn)，7月齡雌性大鼠去勢(shì)后ALP 增加，而雄性大鼠去勢(shì)后ALP 減少，12月齡大鼠去勢(shì)后表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)但改變不明顯。推測(cè)雌性大鼠ALP 的增加與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的去卵巢后大鼠骨轉(zhuǎn)換率的增加有關(guān)；而雄性激素缺乏時(shí)首先引起骨量迅速丟失及重建增加，但隨時(shí)間增長(zhǎng)骨形成反而降低。去勢(shì)后7月齡雌雄大鼠血清鈣均明顯降低，12月齡大鼠則表現(xiàn)不明顯。推測(cè)是12月齡大鼠自身性激素水平低故去勢(shì)后上述變化不明顯。

綜合上述結(jié)果：7、12月齡的雌雄大鼠去勢(shì)后均能形成骨質(zhì)疏松，但12月齡雌性大鼠去勢(shì)后所形成的骨質(zhì)疏松雖然在微觀形態(tài)上（組織計(jì)量學(xué)）有所表現(xiàn)，但在宏觀表現(xiàn)上（如生物力學(xué)、骨重量、長(zhǎng)度等）均表現(xiàn)不明顯。因此，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果不推薦用12月齡的雌性大鼠建立去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型。與7月齡大鼠相比，12月齡大鼠可形成增齡性骨質(zhì)疏松，但增齡對(duì)雌性大鼠的影響比雄性更為明顯。因此，用7月齡的雌雄大鼠建立去勢(shì)致骨質(zhì)疏松模型分別模擬婦女絕經(jīng)后和男性骨質(zhì)疏松是確實(shí)可行的，用12月齡雄性大鼠去勢(shì)則可模擬老年性骨質(zhì)疏松。老齡雄鼠ORX 后造成的骨量減少可能涵蓋了增齡和去勢(shì)的雙重作用。

另外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)骨組織計(jì)量學(xué)、生物力學(xué)、骨密度、長(zhǎng)度、直徑等的變化常表現(xiàn)不一致甚至相反（如雌雄大鼠組織計(jì)量學(xué)與生物力學(xué)的結(jié)果是相反的）。其原因是與其它材料相比，骨的本質(zhì)區(qū)別在于它是有生命的器官，能不斷地進(jìn)行再建活動(dòng)，使骨能在承載變化的情況下，通過(guò)自動(dòng)反饋控制系統(tǒng)使內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外表形態(tài)適應(yīng)外力環(huán)境的變化。骨的力學(xué)性能除了與骨量有關(guān)外，還與骨的幾何形態(tài)、骨膠原纖維的結(jié)構(gòu)和礦化程度等密切相關(guān)。通常骨組織計(jì)量學(xué)比力學(xué)指標(biāo)及骨密度等的變化更明顯和提前出現(xiàn)。但僅從組織計(jì)量學(xué)的指標(biāo)判斷骨質(zhì)疏松是片面的，血清生化指標(biāo)能反映骨代謝但所受影響因素較多只能作為模型判斷的輔助指標(biāo)。因此，判斷骨質(zhì)疏松的形成應(yīng)從骨組織計(jì)量學(xué)、生物力學(xué)、骨密度、血清生化等多方面進(jìn)行綜合分析，并根據(jù)抗骨質(zhì)疏松藥物作用對(duì)象的特點(diǎn)選擇適合的年齡與性別的動(dòng)物建立骨質(zhì)疏松模型。

［1］ 劉鈺瑜，吳鐵.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2002.7（6）：570－573.

［2］ 徐叔云，卞如濂.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第三版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1560－1566.

［3］ D D THOMPSON，H A SIMMONS.FDA guidelines and animal models for osteoporosis［J］.Bone，1995，17（10）.

［4］ 許碧連，吳鐵，崔燎，等.大鼠去卵巢后對(duì)不同部位骨骼的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9（10）.

［5］ 王鑫國(guó)，郭秋紅，白霞，等.年齡對(duì)大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型的影響［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2008，15（4）.

［6］ 李恩，薛延，等.骨質(zhì)疏松鑒別診斷與治療［M］.第一版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：620－625.