王鑫煜，林森洪，張作法*

(1.浙江眾博堂生物科技有限公司，浙江 杭州 31000； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，浙江 杭州 310021)

研究發(fā)現(xiàn)，自由基能夠引起人體內(nèi)癌癥、糖尿病、心血管疾病等多種慢性病的發(fā)生，而抗氧化劑可以降低慢性病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前人工合成的抗氧化劑用的比較多，但是這類物質(zhì)對(duì)人體及動(dòng)物有一定的毒副作用。天然抗氧化活性物質(zhì)是從動(dòng)植物中提取的一類具有抗氧化活性物質(zhì)，具有安全無毒的特點(diǎn)[2]。因此，天然抗氧化活性物質(zhì)越來越被人們所關(guān)注[3]。

糖尿病作為21世紀(jì)的流行病，已成為繼心腦血管病、癌癥之后的第三大疾病，其中2型糖尿病占95%。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制小腸刷狀緣上葡萄糖苷酶活性，從而調(diào)節(jié)控制碳水化合物在腸道的吸收，達(dá)到防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥的目的[4]。目前市售的降血糖藥主要有阿卡波糖和伏格列波糖，然而由于這類藥物也存在一定的不良反應(yīng)，因此，從天然植物中提取的α-葡萄糖苷酶抑制劑越來越受到人們的關(guān)注。

青錢柳別名：搖錢樹、麻柳、清錢李、山麻柳、山化樹等。青錢柳是冰川世紀(jì)幸存下來的珍稀樹種，僅存于中國(guó)[5]。青錢柳被譽(yù)為植物界的大熊貓，醫(yī)學(xué)界的“第三棵樹”。因其特殊的生物活性，被醫(yī)學(xué)界稱為“天然植物胰島素”。研究表明，青錢柳葉中含有大量的生物活性物質(zhì)，其中包括黃酮類、三萜類和多酚類化合物等次生代謝產(chǎn)物[6]。這些物質(zhì)在提高青錢柳的抗逆性和協(xié)調(diào)與環(huán)境關(guān)系上發(fā)揮重要的作用，其合成和積累與初級(jí)代謝產(chǎn)物相比更容易受到環(huán)境條件影響[7]。本試驗(yàn)中通過比較不同海拔高度的青錢柳葉中活性物質(zhì)的含量及生物活性，為青錢柳產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

青錢柳葉子于2019年8月底采自浙江眾博堂生物科技公司遂昌兩個(gè)不同海拔的基地(400 m和1 300 m)。將收集的葉片冷凍干燥后，粉碎過0.15 mm孔篩，置于-70 ℃冰箱中備用。

1.2 提取物的制備

取粉碎好的各樣品約20 g，加入70%乙醇1 000 mL，超聲提取30 min，提取結(jié)束后，過濾，殘?jiān)偌尤?0%乙醇1 000 mL超聲提取1次，合并濾液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，進(jìn)一步冷凍干燥，得提取物。

1.3 活性成分含量測(cè)定

多酚含量。根據(jù)Singleton等[8]的方法略加改動(dòng)。不同濃度樣品液1 mL，加入0.5 mL的福林酚(10%)試劑搖勻，反應(yīng)8 min，再加入10%碳酸鈉溶液2 mL，搖勻，避光反應(yīng)60 min，于750 nm處測(cè)定吸光度。

總黃酮含量。參考文獻(xiàn)[9]。不同濃度的樣品液1 mL，分別加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，振蕩反應(yīng)5 min；再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻振蕩反應(yīng)5 min；最后加入1 M的氫氧化鈉溶液4.0 mL搖勻，反應(yīng)10 min。在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)量吸光度。

1.4 抗氧化活性分析

DPPH自由基清除能力。參照Monica等[10]方法并略加改動(dòng)。取2 mL(不同濃度)樣液置于10 mL離心管中，加入2 mL現(xiàn)配的0.1 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液，混合均勻后，在室溫下反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度。

ABTS清除能力[11]。配制7 mmol·L-1的ABTS+和2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液，并按照1∶1的比例混合后，避光保存12～16 h。用磷酸緩沖溶液(10 mmol·L-1，pH值7.4)稀釋ABTS+儲(chǔ)備液，使其在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度值為0.7±0.02。不同濃度的提取物0.5 mL加入稀釋后的ABTS+溶液2.0 mL，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.5 α-糖苷酶抑制活性試驗(yàn)[12]

以PNPG為底物，阿卡波糖為陽性對(duì)照，測(cè)定青錢柳提取物的酶抑制活性。向不同濃度的青錢柳提取物中依次加入PBS緩沖液和α-葡萄糖苷酶液，于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min，加入底物PNPG溶液，于37 ℃水浴20 min，加入0.2 mol·L-1NaCO3溶液終止反應(yīng)，于405 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔對(duì)青錢柳提取物中總黃酮和多酚含量的影響

不同海拔的青錢柳經(jīng)70%乙醇提取。由圖1可知，低海拔和高海拔的青錢柳提取物中黃酮類含量分別達(dá)到11.86%和14.62%，多酚含量分別達(dá)到17.65%和21.50%；高海拔青錢柳黃酮和多酚含量顯著高于低海拔青錢柳。

圖1 不同海拔對(duì)青錢柳乙醇提取物中黃酮和多酚含量的影響

2.2 不同海拔對(duì)青錢柳提取物DPPH清除活性的影響

DPPH自由基清除法是一種最常用的抗氧化活性方法?？寡趸瘎┠軌蚪oDPPH自由基提供氫原子和電子使其褪色，吸光值越小，其顏色變得越淺表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)[13]。由圖2可知，各樣品的DPPH清除能力與濃度密切相關(guān)。在濃度為0.125～2.00 mg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，低海拔青錢柳提取物的DPPH清除率為25.2%～79.3%，高海拔青錢柳提取物的清除率為37.5%～94.3%。低高海拔的半抑制濃度分別為0.39和0.19 mg·mL-1。

圖2 不同海拔對(duì)青錢柳乙醇提取物DPPH自由基清除活性的影響

2.3 不同海拔對(duì)青錢柳提取物ABTS清除活性的影響

抗氧化劑會(huì)將藍(lán)綠色的ABTS+還原成無色的ABTS，在734 nm處測(cè)定吸光度，吸光度變化越大，其清除能力就越強(qiáng)[14]。由圖3可知，高低海拔的青錢柳提取物均具有較好的ABTS清除活性。各濃度的不同提取物的還原力均低于陽性對(duì)照。在相同濃度下，高海拔青錢柳提取物的ABTS清除活性顯著高于低海拔青錢柳。

圖3 不同海拔對(duì)青錢柳乙醇提取物ABTS自由基清除活性的影響

2.4 不同海拔對(duì)青錢柳提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

α-葡萄糖苷酶是治療2型糖尿病的靶點(diǎn)之一，此類酶能將碳水化合物水解為單糖葡萄糖，是碳水化合物水解的關(guān)鍵酶[15]。而葡萄糖苷酶抑制劑則通過可逆占據(jù)葡萄糖苷酶與糖結(jié)合位點(diǎn)，抑制α-葡萄糖苷酶的活性，從而降低多糖降解，延緩腸道對(duì)碳水化合物的吸收，達(dá)到改善高血糖的效果。

如圖4所示，不同海拔的青錢柳提取物具有不錯(cuò)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但相比阿卡波糖則活性偏低。高海拔青錢柳提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性顯著高于低海拔青錢柳提取物。低海拔青錢柳的半抑制濃度為1.36 mg·mL-1，而高海拔青錢柳提取物的糖苷酶半抑制濃度僅為0.49 mg·mL-1，略高于阿卡波糖。

圖4 不同海拔對(duì)青錢柳乙醇提取物α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

3 小結(jié)與討論

黃酮作為穩(wěn)定的自由基清除劑是在自然界中普遍存在的一類化合物[16]。多酚被稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”[17]，是來源于苯丙氨酸代謝途徑和莽草酸途徑的重要次生代謝物。作為重要的次生代謝物，可減輕人體氧化損傷，預(yù)防癌癥和心血管疾病[18]。黃酮和多酚的代謝受環(huán)境條件的影響，如高光照、高無機(jī)碳利用率，低養(yǎng)分利用率等不利的環(huán)境條件下，植物生長(zhǎng)比植物光合作用更受限制時(shí)，更多的碳才可以用于以碳為基礎(chǔ)的次生代謝產(chǎn)物的生成[19]。

本研究中，高海拔的環(huán)境條件比低海拔更不利于青錢柳的生長(zhǎng)，但卻在很大程度上提高了青錢柳葉中黃酮和多酚的含量。一些研究已經(jīng)證明了抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性與多酚和黃酮化合物之間的關(guān)系[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，氣候、土壤、環(huán)境因素、收獲時(shí)間等諸多因素都可能影響植物的抗氧化活性[21]。青錢柳中的總黃酮和多酚含量與其抗氧化活性和糖苷酶抑制活性呈顯著正相關(guān)。綜上所述，不同海拔造成的環(huán)境條件可以影響青錢柳次生代謝物的累積，從而造成其抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性的不同。高海拔青錢柳含有更高的黃酮和多酚含量，其抗氧化活性與α-葡萄糖苷酶抑制活性也很高。