張爽

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥分院，陜西 咸陽 712046）

大豆異黃酮主要存在于豆科蝶形花亞科植物中，是大豆生長中形成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物。其主要成分是：大豆甙，大豆甙元，染料木甙，染料木素，黃豆黃素，黃豆黃素甙元。由于它是從植物中提取，有著與雌激素相似的結(jié)構(gòu)，因此大豆異黃酮又稱植物雌激素?？煞乐我恍┖痛萍に厮较陆涤嘘P(guān)的疾病，如：延緩女性衰老、改善更年期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松等疾病，同時(shí)可提高機(jī)體免疫力，抗氧化、抗溶血等。目前，大豆異黃酮的檢測方法有：利用紫外吸收特征檢測、色譜原理檢測、醫(yī)學(xué)熒光免疫法檢測。

1 利用紫外吸收特征檢測

1.1 紫外分光光度法

大豆異黃酮結(jié)構(gòu)中的羥基和芳香環(huán)形成較強(qiáng)的共軛體系對(duì)波長在250～260nm的紫外光有較強(qiáng)的特征吸收峰，且它的各組分最大吸收波長相差不大，峰數(shù)目較少?？刹捎米贤夥止夤舛确▽?duì)大豆異黃酮進(jìn)行含量測定。該法簡便，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性及靈敏度較高，使用的試劑毒性小、廉價(jià)易得。黃莉等[1]以染料木素為標(biāo)準(zhǔn)品，在紫外最大吸收峰260nm處，用紫外分光光度法測定大豆豆粕中異黃酮的含量?；貧w方程A=0.1676X-0.0118r=0.9982，平均回收率為99.84%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%。

1.2 三波長法

三波長吸光光度法根據(jù)大豆異黃酮在240nm、260nm、280nm三個(gè)波長處吸光值，分別計(jì)算△A，計(jì)算方法為：△A=A260一(A240+A280)／2?！鰽 與待測物濃度成正比，進(jìn)而求得待測物質(zhì)濃度。在提取大豆異黃酮時(shí)，多用乙醇為溶劑，色素及醇溶性蛋白等也被提取出來。若用單波長法測定，背景會(huì)產(chǎn)生較大吸收，降低了測定的準(zhǔn)確度。三波長法可以有效地消除這些干擾，并且方法簡便，靈敏，省時(shí)，重現(xiàn)性好，所用儀器便宜。鞠興榮等[2]采用三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮含量，有效地消除了隨濃度不同發(fā)生的本底漂移、油脂等干擾物質(zhì)及吸收峰不對(duì)稱給定量分析造成的影響。最低檢出濃度為1μg/ml，加樣回收率99%，具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2 利用色譜的原理檢測

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是目前檢測大豆異黃酮應(yīng)用最廣泛的一種方法。所用色譜柱一般以小粒徑填料填充，其柱效高、分離效果好。同時(shí)，柱后可接多種高靈敏度檢測器，對(duì)流出物可進(jìn)行連續(xù)檢測。此法具有成本低、樣品制備步驟少、準(zhǔn)確性高、儀器自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。張磊等[3]采用HPLC法，Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相:甲醇 20.3%磷酸溶液(體積比 48∶52)，流速 0.7mL/min，測定波長260nm，柱溫25℃。結(jié)果制備的大豆異黃酮苷元總含量為70.98%;大豆苷元、黃豆黃素和染料木素平均回收率分別為98.7%、98.9%和99.2%，RSD分別為2.1%、1.6%和1.4%。

2.2 高效液相色譜～質(zhì)譜法

高效液相色譜一質(zhì)譜法在測定大豆異黃酮含量時(shí)只需3種黃酮糖苷標(biāo)樣就可以對(duì)其進(jìn)行定量分析，解決了單純用高效液相色譜法時(shí)標(biāo)樣缺乏的難題，且該法能迅速準(zhǔn)確的確定檢測大豆異黃酮液相色譜圖中各色譜峰歸屬。是一種先進(jìn)、高效、快捷的分析技術(shù)。以大豆胚芽、大豆粕等原料用60%乙醇提取，高效液相色譜法分析大豆中8種異黃酮成分，并根據(jù)色譜峰的質(zhì)譜特征，鑒定出各種異黃酮。采用 Novapak C18 柱 (Φ3.9×150mm，4μm)，流動(dòng)相為 A-0.1%乙酸/水、B-0.1%乙酸/乙腈，梯度洗脫，柱溫40℃，檢測波長為254nm，外標(biāo)法定量，檢測時(shí)間23min。測定4種異黃酮的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為0.5%～1.2%，回收率99.01%～103.0%。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是以高壓電場為驅(qū)動(dòng)力，毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上差異而實(shí)現(xiàn)分離技術(shù)。該法準(zhǔn)確、可靠、經(jīng)濟(jì)、操作簡便。目前，已逐漸成為測定植物雌激素的常規(guī)方法之一。葉靜等[5]測定豆粕及發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮含量。方法:采用膠束毛細(xì)管電泳法，未涂層彈性石英毛細(xì)管(50μm×60cm，50cm);壓力進(jìn)樣，壓力:3.0×103Pa;進(jìn)樣時(shí)間:5s;分離電壓:17kV;柱溫:20℃;檢測波長:254nm;運(yùn)行緩沖液:15mmol.L-1十二烷基硫酸鈉、5%甲醇的10mmol.L-1硼砂溶液(pH9.4)。結(jié)果:測得6種大豆異黃酮組分在24min內(nèi)能完全分離并具有良好的線性關(guān)系;平均加樣回收率(n=5)在99.6%～103.5%之間，RSD為1.8%～2.3%。

2.4 薄層掃描色譜法

薄層掃描色譜法利用各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同，當(dāng)移動(dòng)相流過固定相時(shí)，連續(xù)產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，來達(dá)到分離各成分的目的。此法適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易變化且不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。該法有靈敏度及分辨率高、分離快速、操作方便、樣品預(yù)處理簡單、設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)。但其薄層顯色劑用量難以準(zhǔn)確控制，人為誤差較大。徐穎等[6]采用聚酰胺薄層色譜法分離鑒定異黃酮，以乙醇-水-甲酸(4∶1∶0.1)為展開劑，染料木甙的Rf值0.70、大豆甙元的Rf值為0.51、染料木素的Rf值為0.43。

2.5 雙向紙層析色譜法

雙向紙層析法適用于分離鑒定復(fù)雜的混合物。方法：以濾紙做載體，利用第一種層析系統(tǒng)進(jìn)行第一向?qū)游龊螅瑢V紙烘干，濾紙旋轉(zhuǎn)90°，用另一層析系統(tǒng)進(jìn)行第二向?qū)游?。該法有著重現(xiàn)性好、特異性高、操作簡單、設(shè)備要求不高的特點(diǎn)。在沒有高效液相色譜儀的情況下，要了解異黃酮提取工藝中每一個(gè)流程異黃酮的變化雙向紙層析色譜法是較為理想的方法。彭義交等[7]采用雙相紙層析方法對(duì)大豆異黃酮進(jìn)行分離，其結(jié)果與液-質(zhì)色譜法基本吻合。

其它還有氣相色譜法和氣相色譜－質(zhì)譜法。氣相色譜法具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、靈敏度及特異性高等優(yōu)點(diǎn)，但此法操作較繁瑣、耗時(shí)長、設(shè)備昂貴。因此，限制了該法推廣。氣相色譜－質(zhì)譜法，靈敏度高，定性能力更準(zhǔn)確，可用于食品中大豆苷元和染料木素常規(guī)分析的方法。這兩種方法國外學(xué)者應(yīng)用的比較多。四標(biāo)樣快速測定法以其準(zhǔn)確、快速、簡單的特點(diǎn)，滿足工業(yè)生產(chǎn)過程中檢測的需要。

3 醫(yī)學(xué)上熒光免疫法

主要包括時(shí)間分辨熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附法。這兩種方法重現(xiàn)性好、特異性高、靈敏、結(jié)果判斷客觀準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)。目前已廣泛在臨床醫(yī)學(xué)中用于研究血漿、尿液及糞便中大豆異黃酮體檢測。

[1] 黃莉等.紫外分光光度法測定豆粕中大豆異黃酮的含量[J].科技信息，2010年26期.

[2] 鞠興榮等.三波長紫外分光光度法測定大豆異黃酮的研究[J].食品科學(xué)，2001年5期.

[3] 張磊等.大豆異黃酮苷元檢測方法的研究[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008年2月第24卷.

[4] 龔凌霄等.高效液相色譜-質(zhì)譜法快速測定大豆異黃酮含量[J].中國油脂，2006年2期.

[5] 葉靜等.膠束毛細(xì)管電泳測定豆粕及發(fā)酵豆粕中大豆異黃酮含量[J].中國藥學(xué)雜，2010年3期.

[6] 徐穎等.聚酰胺薄層色譜法分離鑒定異黃酮[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2005年第5期.

[7] 彭義交等.大豆異黃酮雙向紙層析分析方法的研究[J].食品科學(xué)，2004年第4期.