劉道峰鄧省亮賴衛(wèi)華夏 駿

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330029；3.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌 330029）

萊克多巴胺熒光微球免疫層析檢測方法的建立

劉道峰1鄧省亮2賴衛(wèi)華1夏 駿3

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330029；3.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西 南昌 330029）

以熒光微球作為新型標(biāo)記物，采用EDC法進行偶聯(lián)，制備萊克多巴胺抗體熒光微球復(fù)合物，復(fù)合物粒度均一、性質(zhì)穩(wěn)定，并以之為探針建立萊克多巴胺熒光微球免疫層析檢測方法，檢測限為2.5 ng／m L，且特異性強、檢測范圍寬。與膠體金免疫層析方法相比，熒光微球免疫層析方法的靈敏度更高，新型的熒光微球可以提高免疫層析方法的靈敏度。

熒光微球；萊克多巴胺；免疫層析；檢測

萊克多巴胺（ractopamine，Rac）是一種屬于苯胺類的β－受體激動劑，主要以鹽酸鹽形式存在。其具有重新分配機體營養(yǎng)、抑制脂肪沉積、提高蛋白質(zhì)含量、增加酮體瘦肉率、改善肉質(zhì)以及促進動物生長的作用［1－3］。因此，近年來在經(jīng)濟利益的驅(qū)使下，大量萊克多巴胺被濫用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)。人體攝入Rac的量過大時，會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，主要有肌肉震顫、心跳和呼吸加快等，嚴(yán)重的會危害生命。鑒于此，許多國家已經(jīng)禁止將萊克多巴胺作為飼料及飼料添加劑使用。如歐盟于1996年便明令禁止在畜牧生產(chǎn)中使用包括萊克多巴胺在內(nèi)的所有β－腎上腺素興奮劑類藥物，中國農(nóng)業(yè)部亦于2002年明確將其列入《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》。

目前，檢測萊克多巴胺比較經(jīng)典的方法有高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC－MS）［4］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［5］、高效液相色譜法（HPLC）［6］，這些都是比較傳統(tǒng)的辦法，亦是目前的確證方法［7，8］。另外，目前常用的還有酶聯(lián)免疫（ELISA）［9］的方法。但由于以上方法均需先進檢測儀器、檢測費用昂貴、步驟繁瑣、耗時，且對操作人員專業(yè)性要求較高，不適用于基層企事業(yè)單位的大通量快速篩查檢測。因此，研究萊克多巴胺的快速篩查方法有重要的意義。

熒光微球（fluorescent microspheres，F(xiàn)Ms）是指將熒光染料通過物理和化學(xué)等方法吸附或包埋到粒子內(nèi)而形成的，直徑在納米至微米級（0.01～10μm）范圍內(nèi)，受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒。相比膠體金等傳統(tǒng)標(biāo)記物（須大量聚集才會被辨別出［10］），它的發(fā)光強度可以隨激發(fā)光的強度增強而增強，所以熒光微球標(biāo)記有望提高免疫層析技術(shù)的檢測限。在微球殼結(jié)構(gòu)的作用下，熒光微球具有相對穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高、重復(fù)性好，有較好的生物相容性［11］。形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強而穩(wěn)定，且基本不受外界環(huán)境介質(zhì)變化的影響［12］。因此，熒光微球作為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)有較高的研究價值與前景。本試驗以熒光微球作為標(biāo)記物，初步建立了一種快速、靈敏的現(xiàn)場檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、OVA：美國Sigma公司；

BSA：瑞士Roche公司；

1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC）：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

NC膜：CN140，德國Sartorious公司；

熒光微球（52.9 mg／m L，表面羧基400 nmol／mg）、Anti－Rac單克隆抗體、Rac全抗原、膠體金、免疫微球復(fù)溶液：江西中德生物工程有限公司。

1.2 主要設(shè)備

點噴系統(tǒng)：BIO－DOT XYZ－3050，美國BIO－DOT公司；

熒光分光光度計：F4500，日本Hitachi公司；

超細微粒粒度分析儀：ZLS Nicomp380，美國PSS公司；

水處理系統(tǒng)：Milli－Q，美國Millipore公司；

可編程切條機：HGS－201，浙江杭州峰航科技有限公司；

高速冷凍離心機：H－2050R，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；

磁力攪拌器，HJ－6，江蘇金壇吉特儀器廠；

真空干燥箱：DZX－6090B，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫微球合成及表征 以5 m L標(biāo)記體系分別標(biāo)記30，40，50μg／mg（抗體／微球）的免疫微球，具體方法：燒杯（用前鉻酸浸泡3 d，再用蒸餾水洗滌并浸泡1 d，p H 5.0的PB緩沖液潤洗30 min）中加入定量的PB緩沖液（p H 5.0，下同），加入熒光微球2.5 mg，快速攪拌下加入相應(yīng)標(biāo)記量的抗體（稀釋10倍并緩慢加入），再緩慢加入10 mg／m L EDC 19.2μL（與微球表面羧基摩爾量相等），保證最終體系體積為5 m L。室溫緩慢攪拌反應(yīng)2 h，再加入500μL 10% （m／m）BSA 封 閉 30 min。8 000 r／min，10 ℃ 離 心10 min，棄上清，并以PB清洗，相同條件離心，重懸于500μL免疫微球復(fù)溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

另分別取熒光微球和不同免疫熒光微球，多次清洗，超純水重懸，以超細微粒粒度分析儀分別測定不同微球粒度及zeta電位，以熒光分光光度計連續(xù)掃描各微球熒光光譜。

1.3.2 結(jié)合墊制備 以 XYZ3050點噴系統(tǒng)分別將1.3.1步驟中免疫微球復(fù)溶液重懸后的3種熒光微球噴涂到結(jié)合墊上，噴涂量4μL／cm，得到不同標(biāo)記量的3種結(jié)合墊，30℃真空干燥2 h，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Rac NC膜的制備與處理 用XYZ3050點噴系統(tǒng)分別在NC膜的適當(dāng)位置噴涂Rac全抗原、羊抗鼠二抗形成檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線），30℃真空干燥1 h，制成Rac NC膜，干燥環(huán)境保存。另取Rac NC膜分別于0.5%BSA（m／m）、0.5%OVA（m／m）中封閉10 min，超純水漂洗殘余封閉劑，瀝干水分，30℃真空干燥1 h，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光微球標(biāo)記免疫層析試紙條組裝 分別取1.3.2步驟得到的30，40，50μg／mg不同標(biāo)記量結(jié)合墊與1.3.3步驟所得的BSA封閉、OVA封閉與未封閉的NC膜，于干燥環(huán)境中，依次按聚酯膜、樣本墊、結(jié)合墊、Rac NC膜、吸水墊的順序?qū)⒏鞑糠终迟N于試紙條PVC底板上，用切條機切成4 mm寬的試紙條，組裝卡殼，干燥保存。

1.3.5 熒光微球免疫層析檢測方法的判定 將試紙條平放，滴加樣品待檢液80μL于加樣孔，5 min后于手持式熒光讀取儀中觀察。若T線顯色（有可見條帶）則判讀為陰性，樣本中不含Rac或低于檢測限；T線不顯色（無可見條帶）則判讀為陽性，樣本溶液中Rac濃度大于檢測限。若C線不顯色，則判定為試紙條無效。

1.3.6 熒光微球免疫層析試紙條參數(shù)選取與評價

（1）免疫層析最佳參數(shù)選?。簩ac標(biāo)品用甲醇溶解，并用PBS稀釋至1 000，100，20，10，5，2.5，1.25 ng／m L。分別向不同組試紙條滴加以上濃度標(biāo)品80μL，同時以PBS作陰性對照，按1.3.5所述檢測方法分別判斷不同組試紙條顯色情況。擇優(yōu)作為本方法最終條件。

（2）靈敏度及檢測范圍的測定：Rac標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇溶解，PBS調(diào)整終濃度為10 000，1 000，100，40，20，10，5，2.5，2，1.25 ng／m L，將優(yōu)化后試紙條，以1.3.5所述方法在Rac濃度0～10 000 ng／m L間判讀結(jié)果，每個濃度重復(fù)5次。

（3）方法特異性：用甲醇稀釋RAC的結(jié)構(gòu)類似物西馬特羅、特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇至1 mg／m L，再用PBS緩沖液稀釋至終濃度為1，5，10，50，100，500 ng／m L。以1.3.5所述的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測，每個濃度重復(fù)5次，判斷試紙條的檢測特異性。

（4）與膠體金方法的比較：參閱文獻［9］將試驗所用Anti－Rac單克隆抗體標(biāo)記到膠體金上，按其相應(yīng)方法優(yōu)化工藝參數(shù)并組裝成膠體金免疫層析試紙條。按1.3.6（2）方法同時將膠體金試紙條與熒光微球試紙條在Rac濃度為0，1.25，2.5，3，4，5，6，7，8，10，20 ng／m L的添加水平上判斷試紙條響應(yīng)情況及靈敏度，每濃度3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光微球的表征

2.1.1 zeta電位及粒度 由圖1和圖2可知，微球偶聯(lián)前后在純水中均帶負電荷，zeta電位相對時間均比較穩(wěn)定；偶聯(lián)前，微球平均粒徑為232.8 nm，顆粒多分散性指數(shù)（Variance）為0.167。表明所用微球在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，顆粒規(guī)則、大小均勻。

偶聯(lián)后zeta電勢有所下降，平均粒徑有所增大（316.8 nm），表明由EDC介導(dǎo)的通過表面羧基的偶聯(lián)方法成功，多分散性指數(shù)依然較?。?.275），說明得到的免疫微球顆粒均一，適合作為免疫層析檢測探針。

圖1 偶聯(lián)前后微球zeta電位Figure 1 Zeta potential of FMs before and after coupling reaction

圖2 偶聯(lián)前后微球粒度分布Figure 2 Size distribution of FMs before and after coupling reaction

2.1.2 熒光微球光學(xué)性質(zhì) 經(jīng)熒光分光光度計連續(xù)掃描發(fā)現(xiàn)所用微球最大激發(fā)波長為462.4 nm，最大發(fā)射波長為592.8 nm，說明所用熒光微球有較大的Stokes位移，意味著在此微球標(biāo)記的免疫層析檢測中激發(fā)光及發(fā)射光可以更輕松地被分開，背景干擾較低，故以此微球做免疫層析標(biāo)記物有較強優(yōu)勢。

由圖3可知，經(jīng)過偶聯(lián)后，不同抗體標(biāo)記量的微球發(fā)射光譜峰型規(guī)則，熒光強度有所降低，但仍與偶聯(lián)前有相同的峰位，發(fā)射譜峰未見漂移。說明偶聯(lián)后熒光微球的發(fā)光顏色與抗體的標(biāo)記量無關(guān)，偶聯(lián)過程不會造成微球光學(xué)性質(zhì)的改變。

圖3 偶聯(lián)前與不同標(biāo)記量微球熒光光譜Figure 3 Fluorescence spectra of FMs and FMs coupled with different amount of antibody

綜上所述，偶聯(lián)后的Rac免疫微球性質(zhì)穩(wěn)定、顆粒規(guī)則、大小均勻，有較好而且穩(wěn)定的光學(xué)特性，適合作為免疫層析的標(biāo)記物。

2.2 不同免疫層析參數(shù)最低檢測濃度結(jié)果

不同標(biāo)記量與NC膜不同處理方式的試紙條的最低檢測濃度見表1。

表1 不同試紙條最低檢測濃度Table 1 LOD of different lateral flow strips／（ng·m L－1）

2.3 標(biāo)記量的選擇

如表1所示，在所測范圍內(nèi)，降低抗體的標(biāo)記量，檢測靈敏度隨之提高，但同時相應(yīng)T線條帶的清晰度也會減弱。試驗中顯示，30μg／mg標(biāo)記量與40μg／mg標(biāo)記量檢測限差異不顯著，但相比之下，30μg／mg標(biāo)記量陰性（圖4（a））與陽性（圖4（b））區(qū)分性差，40μg／mg標(biāo)記量的陰性兩條帶更清晰，陰性與陽性對比明顯（圖4（c）、圖4（d）），判讀更容易。

綜合考慮，層析方法選擇40μg／mg抗體標(biāo)記量的免疫微球。

圖4 不同標(biāo)記量試紙條對比Figure 4 Strips with different coupling ratio

2.4 NC膜處理方式選擇

由于NC膜是多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膜，因此可能與生物大分子及較大顆粒發(fā)生不利于層析檢測的非特異性吸附。采用封閉劑封閉是降低這種非特異性吸附的有效手段，本試驗對比了NC膜不同處理方式（包括不封閉NC膜、BSA封閉NC膜、OVA封閉NC膜）對檢測限及熒光微球在NC膜上涌動性能的影響。

由表1可知，在不封閉的情況下采用極高的濃度依然難以阻斷，并且阻斷的濃度并不完全隨抗體標(biāo)記量的升高而升高，因此，NC膜不封閉條件下的顯色是不確定性的、非特異性的。經(jīng)封閉后，NC膜的非特異性吸附降低，阻斷反應(yīng)正常，免疫層析的檢測靈敏度也有相應(yīng)提高，故NC膜的封閉是十分必要的。此外，在相同標(biāo)記量下，OVA封閉NC膜后最低檢測濃度也低于BSA封閉。

在對熒光微球涌動性影響上，非特異性的吸附會造成熒光微球在NC膜上釋放性差，導(dǎo)致NC膜前端有明顯熒光微球殘留，即存在月牙狀熒光亮線（圖5（a））。試驗中未封閉（a）與BSA封閉（b）試紙條均有不同程度殘留，而以0.5%OVA為封閉劑可大大提高微球涌動性能，多次重復(fù)未發(fā)現(xiàn)殘留（圖5（c）），未影響T線條帶觀察。

故OVA體系是較為理想的封閉劑，層析方法中NC膜的封閉選擇0.5%的OVA。

2.5 靈敏度及檢測范圍

由表2可知，優(yōu)化后（結(jié)合墊微球標(biāo)記量40μg／mg，NC膜以0.5%OVA封閉）該方法有效檢測限為2.5 ng／m L，試紙條檢測結(jié)果在0～10 000 ng／m L濃度范圍內(nèi)有效。

表2 Rac熒光微球標(biāo)記試紙條檢測范圍+Table 2 Responses of fluorescent lateral flow strips to different Rac level

2.6 特異性

由表3可知，Rac的幾種常見結(jié)構(gòu)類似物沙丁胺醇、西馬特羅、克倫特羅、特布他林不會與本免疫層析試紙條發(fā)生交叉反應(yīng)，表明本方法特異性良好。

表3 Rac熒光微球標(biāo)記試紙條特異性結(jié)果+Table 3 Specificity of fluorescent lateral flow strips for detecting Rac

2.7 與膠體金免疫層析方法的比較

由表4可知，相同條件下，選膠體金為標(biāo)記材料的層析試紙條有效檢測限為5 ng／m L，此值高于熒光微球標(biāo)記的層析試紙條的檢測限（2.5 ng／m L）?？梢姡诟偁幠Ｊ降膶游鰴z測方法中，相比于膠體金，熒光微球可以明顯提高免疫層析方法的靈敏度。

表4 熒光微球免疫層析與膠體金免疫層析方法的比較+Table 4 Responses of strips based on FMs and colloidal gold

3 總結(jié)與討論

目前，膠體金標(biāo)記為代表的免疫層析檢測技術(shù)已經(jīng)在食品安全領(lǐng)域有了較多應(yīng)用，但以膠體金為代表的此類吸收光譜型標(biāo)記物須大量聚集才會產(chǎn)生肉眼可見信號［10］，限制了免疫層析檢測技術(shù)的檢測靈敏度。而熒光微球等發(fā)射光譜型標(biāo)記物因信號強度可隨激發(fā)光增強而增強，因此在理論上可以有效降低層析方法的檢測限。本試驗以EDC介導(dǎo)的一步法偶聯(lián)，合成了適用于免疫層析檢測的熒光微球探針，熒光微球粒度均一、化學(xué)及光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；建立了此熒光探針標(biāo)記的以萊克多巴胺為目的物的免疫層析檢測方法，最終檢測限可達2.5 ng／m L，靈敏度高于同條件下膠體金層析檢測試紙條及文獻［12］報道膠體金免疫層析方法，從而證明了熒光微球等激發(fā)光譜型標(biāo)記物在免疫層析過程中作為標(biāo)記物有著較強的優(yōu)勢。崔浩等［13］采用物理方法將Rac抗體和熒光乳膠顆粒偶聯(lián)，得到的免疫層析檢測試紙條靈敏度高、效果較好，也可以印證這一結(jié)論。另外，經(jīng)初步探索，本方法Rac完全阻斷濃度已為2.5 ng／m L，若采用更高質(zhì)量的抗體偶聯(lián)微球并作進一步工藝優(yōu)化，靈敏度仍有上升的空間。如果結(jié)合熒光讀取分析儀器使用，靈敏度則會有更高的提升。

1 Carr S N，Hamilton D N，Miller K D，et al.The effect of ractopamine hydrochloride（Paylean?）on lean carcass yields and pork quality characteristics of heavy pigs fed normal and amino acid fortified diets［J］.Meat Science，2009，81（3）：533～539.

2 López－Carlos M A，Ramírez R G，Aguilera－Soto J I，et al.Effect of ractopamine hydrochloride and zilpaterol hydrochloride on growth，diet digestibility，intake and carcass characteristics of feedlot lambs［J］.Livestock Science，2010，131（1）：23～30.

3 Xiao R J，Xu Z R，Chen H L.Effects of ractopamine at different dietary protein levels on growth performance and carcass characteristics in finishing pigs［J］.Animal Feed Science and Technology，1999，79（1－2）：119～127.

4 Dong Y，Xia X，Wang X，et al.Validation of an ultra－performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry method for determination of ractopamine：Application to residue depletion study in swine［J］.Food Chemistry，2011，127（1）：327～332.

5 He L M，Su Y J，Zeng Z L，et al.Determination of ractopamine and clenbuterol in feeds by gas chromatography－mass spectrometry［J］.Animal Feed Science and Technology，2007，132（3－4）：316～323.

6 程盛華，楊春亮，鄭龍，等.高效液相色譜法測定動物組織中的萊克多巴胺殘留量［J］.分析儀器，2009（4）：69～72.

7 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗總局.GB／T 22147——2008飼料中沙丁胺醇、萊克多巴胺和鹽酸克侖特羅的測定 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

8 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗總局.GB／T 22286——2008動物源性食品中多種β－受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

9 金晶.ELISA法和膠體金免疫層析法檢測豬尿樣中的萊克多巴胺［D］.南昌：南昌大學(xué)，2007.

10 吳剛，姜瞻梅，霍貴成，等.膠體金免疫層析技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用［J］.食品工業(yè)科技，2007（12）：216～218.

11 吳偉兵，王明亮，景宜，等.單分散熒光微球的制備及其光學(xué)性能研究［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，34（3）：15～19.

12 郭荷梅，杜紅麗，劉文生，等.萊克多巴胺膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：82～84.

13 崔浩，陳耀強，唐勇，等.萊克多巴胺熒光膠乳顆粒免疫層析檢測法的建立［J］.分析測試學(xué)報，2011，30（7）：764～768.

Development of lateral flow assay of ractopamine based on fluorescent microspheres

LIU Dao－feng1DENG Sheng－liang2LAI Wei－h(huán)ua1XIA Jun3

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang，Jiangxi330029，China；3.Jiangxi Province Institute of Veterinary Drug and Feed Control，Nanchang，Jiangxi330029，China）

A composition，with a stable character and uniform size，and which contains fluorescent microspheres as a novel label，was obtained successfully by a EDC one－step method.A fluorescent lateral flow assay for detecting ractopamine which has high sensitivity（LOD available is 2.5 ng／m L），satisfying specificity and a wide range for detecting was developed based on this composition as probe.The method of fluorescent microspheres lateral flow assay is more sensitive than that of colloidal gold lateral flow assay.The novel fluorescent microspheres do contribute to improve the sensitivity of immunochromatographic assay.

fluorescent microspheres；ractopamine；immunochromatography；detection

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.019

國家自然科學(xué)基金項目（編號：30960301）；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（編號：GJJ09284）。

劉道峰（1988－），男，南昌大學(xué)在讀碩士研究生。Email：defoelau＠163.com

賴衛(wèi)華

2011－08－01