黃麗燕，韓磊，劉青，劉珍伶，李珍珍

（1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021；2.蘭州大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730000）

枇杷葉總黃酮的提取及其脂質(zhì)體的抗氧化活性

黃麗燕1，韓磊1，劉青1，劉珍伶2，李珍珍1

（1.華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021；2.蘭州大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730000）

采用乙醇回流法提取枇杷葉中黃酮類物質(zhì)，制備黃酮脂質(zhì)體，并考察其抗氧化活性及各因素對總黃酮提取率的影響.優(yōu)化總黃酮脂質(zhì)體制備處方，并測定其抗氧化活性.優(yōu)化結(jié)果表明：最佳提取工藝中乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1：60，提取溫度為80℃，提取時間為1.5h；黃酮脂質(zhì)體最佳處方中卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，卵磷脂與黃酮的質(zhì)量比為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為5.8.體外抗氧化結(jié)果顯示：不同質(zhì)量比的黃酮及其脂質(zhì)體對豬油都具有一定的抗氧化作用，且隨著其劑量的增加而增強；質(zhì)量分數(shù)相同時，黃酮脂質(zhì)體的抗氧化效果優(yōu)于黃酮溶液，且與抗壞血酸有較好的協(xié)同抗氧化增效作用.

枇杷葉；黃酮；脂質(zhì)體；抗氧化

黃酮是一類重要的有機化合物，其藥用價值已引起人們的廣泛關(guān)注［1］.由于黃酮有較強的抗氧化活性，與合成抗氧劑（如二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚等）等相比，具有高效、低毒、價廉、易得等優(yōu)點，日益受到重視.然而，黃酮易氧化，將其制成載藥脂質(zhì)體后，可提高黃酮的穩(wěn)定性.脂質(zhì)體具有緩釋作用，可達到抗氧化的長效作用，且脂質(zhì)體低毒、生物降解性好，將黃酮制備成脂質(zhì)體后有很好的應(yīng)用前景.近年來，國內(nèi)外都非常重視將黃酮類化合物開發(fā)成食品添加劑，已開發(fā)添加黃酮類化合物的可樂型飲料、面包、啤酒等，其口感好、易保存、不用另加保鮮劑，并且添加物本身具有一定的抑菌、殺菌等功效［2］.枇杷在我國分布廣泛，枇杷葉是我國傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、止咳作用.黃酮是枇杷葉中的主要有效成分之一［3］.目前，種植的枇杷主要是采摘果實，枇杷葉是廢棄物而未得到有效利用，既浪費又污染環(huán)境.本文從枇杷葉中提取、分離總黃酮，制備成黃酮脂質(zhì)體，并對其抗氧化性能進行研究.

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

蘆丁標準品（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院）；枇杷葉（華僑大學）；抗壞血酸、亞硝酸鈉、冰乙酸、可溶性淀粉、大豆卵磷脂、膽固醇、石油醚（60～90℃）等（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）.

752N型紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TDL－60B型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；BS124S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH－S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，XH－C型旋渦混合器（江蘇常州市國立試驗設(shè)備研究所）；R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；S－3500N型掃描電子顯微鏡（日本日立公司）.

1.2 材料處理

采摘新鮮枇杷葉，用自來水將其背面絨毛等雜物沖洗干凈，晾至表面無水，置于60℃烘箱，粉碎過60目篩備用.

1.3 蘆丁標準曲線

準確稱取10mg于120℃下干燥恒定質(zhì)量的蘆丁標準品，加入體積分數(shù)為60%的乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，搖勻可得0.1g·L－1的蘆丁標準液.分別取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL的標準液于25mL容量瓶中，不足10mL的用60%乙醇補足，加入0.8mL，5%的NaNO2試液，混勻，放置6min.然后，加入0.8mL，10%的 Al（NO3）3溶液，混勻，放置6min，再加入10mL，1.0mol·L－1的NaOH溶液，混勻，用蒸餾水定容至25mL，搖勻，放置15min.最后，在510nm處測混合液的光密度，以光密度值D（510）對蘆丁質(zhì)量濃度C作標準曲線圖.由此可得標準曲線方程為Y＝9.95 X－0.013 8，相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 5，在0.01～1.00g·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

1.4 枇杷葉總黃酮醇提工藝［4-7］

提取液經(jīng)粗濾和石油醚萃取后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸干，產(chǎn)品用60%的乙醇定容至100mL容量瓶中，搖勻備用.然后，精確吸取1.0mL提取液，其他操作與節(jié)1.3相同，測定其在510nm光密度值以確定其濃度.

1.5 枇杷葉黃酮脂質(zhì)體的制備［6-10］

1.5.1 空白脂質(zhì)體 稱取0.37g的磷酸氫二鈉與2.0g的磷酸二氫鈉，加蒸餾水適量，溶解并稀釋至1L（pH＝5.7），配制成磷酸鹽緩沖液（PBS）.稱取0.9g的大豆卵磷脂和0.3g膽固醇于50mL小燒杯中，加1～2mL無水乙醇，置于65～70℃水浴中，攪拌使溶解，旋轉(zhuǎn)該小燒杯使磷脂的乙醇液在杯壁上成膜，用吸耳球輕吹風，將乙醇揮去.另取30mL磷酸鹽緩沖液于小燒杯并置于65～70℃水浴中，保溫待用.取預(yù)熱的30mL磷酸鹽緩沖液，加至含有磷脂和膽固醇脂質(zhì)膜的小燒杯中，于65～70℃水浴中攪拌水化10min；隨后將小燒杯置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌30～60min，如果溶液體積減少，可補加水至30mL，混勻，即得空白脂質(zhì)體.最后，將所得脂質(zhì)體溶液通過0.45μm微孔濾膜兩遍，進行整粒，于電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài).

1.5.2 黃酮脂質(zhì)體 首先確定影響脂質(zhì)體包封率、形態(tài)、粒徑分布的3種主要因素，即卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比、卵磷脂與黃酮質(zhì)量比、磷酸緩沖液pH值.各因素設(shè)定3水平，依據(jù)L9（33）做正交試驗.稱取一定量的卵磷脂、膽固醇置500mL的圓底燒瓶中，加入1～2mL無水乙醇，將乙醇提取的黃酮溶液經(jīng)抽濾旋轉(zhuǎn)蒸干后用磷酸鹽緩沖液進行稀釋.實驗中，除將磷酸鹽緩沖液換成枇杷葉的黃酮溶液外，其他步驟同空白脂質(zhì)體制備，即采用被動載藥的方法制備的黃酮脂質(zhì)體.

1.6 測定方法

1.6.1 枇杷葉黃酮脂質(zhì)體包封率的測定［11-12］準確吸取等量空白脂質(zhì)體和黃酮脂質(zhì)體于兩支離心管中，8 000r·min－1離心20min，將上清液以離心后的空白脂質(zhì)體作為對照，進行光密度值測定，代入蘆丁標準曲線回歸方程，可得未包入脂質(zhì)體中藥物量（ρ游）.另準確吸取等量空白脂質(zhì)體和黃酮脂質(zhì)體于試管中，分別加適量無水乙醇破乳，漩渦3min后，以8 000r·min－1離心20min，取上清液以空白脂質(zhì)體為對照，測定光密度值，代入蘆丁標準曲線回歸方程，可得總藥物量（ρ總）.包封率（η）的計算為

η＝ （ρ總－ρ游）／ρ總×100%.

1.6.2 過氧化值的測定［13-17］稱取7份30g油脂于容器（1份為空白對照組，1份為脂質(zhì)體空白對照組，2份分別按油的質(zhì)量的0.05%，0.50%添加黃酮，2份按油的質(zhì)量的0.05%，0.50%添加黃酮脂質(zhì)體，1份按油的質(zhì)量的0.05%添加特丁基氫醌（TBHQ）作為對比組）中，混合均勻，置于（60±0.5）℃的恒溫烘箱中，每隔12h攪拌1次，并交換其在烘箱中的位置.定時取樣檢測豬油的過氧化值（POV）.過氧化值測定按國家標準GB／T 5009.37－2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》的規(guī)定進行操作.

1.6.3 協(xié)同抗氧化性能的測定 選用抗壞血酸（Vc）作為增效劑，與黃酮脂質(zhì)體按一定比例混合均勻一起加入基質(zhì)油中進行觀察、測定.

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷葉總黃酮的醇提優(yōu)化［5］

在單因素考察的預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)（φ）、提取時間（t）、提取溫度（θ）、料液比（m∶V）作為考察因素，依據(jù)L9（34）做正交試驗，結(jié)果如表1所示.表1中：γ為黃酮得率；R為極差.

用極差分析法對試驗的因素進行顯著性分析，如表2所示.表2中：SS為平方和；DF為自由度；MS為均方值；F為均方比.從表2可知：因素A的均方比FA為146.4，遠大于F臨界值（F0.05（2，2）＝19.00），即乙醇體積分數(shù)對黃酮得率有非常顯著的影響，而提取時間、料液比、提取溫度對黃酮得率影響不大.實驗中，A，B，C，D4個因素對枇杷葉總黃酮得率的影響程度不同，各因素的影響程度依次為A＞C＞D＞B.結(jié)果顯示：枇杷葉總黃酮最佳提取工藝為A2B2C3D3，即乙醇體積分數(shù)為70%，提取時間為1.5h，提取溫度為80℃，料液比為1∶60.

表1 枇杷葉總黃酮的醇提正交實驗結(jié)果Tab.1 Orthogonal experiment results of flavonoids extracted from loquat

表2 枇杷葉總黃酮的醇提正交實驗方差分析Tab.2 Variance analysis of flavonoids extracted from loquat

按最優(yōu)條件進行試驗，驗證結(jié)果是否與預(yù)期指標值接近，以證明正交實驗得出的工藝條件的穩(wěn)定可靠性.結(jié)果表明：在正交優(yōu)化條件下，乙醇提取試驗的黃酮5次平均得率為12.216%，相對標準偏差值為5.73%，重現(xiàn)性較好.

2.2 黃酮脂質(zhì)體的制備處方優(yōu)化

2.2.1 脂質(zhì)體的形態(tài)觀察 脂質(zhì)體是由卵磷脂和膽固醇為骨架膜材料制成的，具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊狀體，是因為常見的磷脂分子結(jié)構(gòu)有兩條較長的疏水烴鏈和一個親水基團，而中間的囊狀體有兩條較長的可以包封所需要的藥物.空白脂質(zhì)體和黃酮脂質(zhì)體在油鏡下的形態(tài)，如圖1所示.從圖1可以看到：空白脂質(zhì)體中的磷脂雙分子層及中間的空白囊狀體，類似與細胞的雙層膜結(jié)構(gòu)，說明所制備的空白脂質(zhì)體比較完整；脂質(zhì)體中包裹了黃酮分子.

圖1 脂質(zhì)體在油鏡下的形態(tài)Fig.1 Liposomes under the oil immersion lens

2.2.2 黃酮脂質(zhì)體的制備處方優(yōu)化 選取卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（m1∶m2）、卵磷脂與黃酮的質(zhì)量比（m1∶m3）、磷酸鹽緩沖液pH值作為考察因素，依據(jù)L9（33）做正交實驗，結(jié)果如表3所示.采用極差分析法對試驗因素進行顯著性分析，結(jié)果如表4所示.

從表4可知：A，B，C3個因素對黃酮脂質(zhì)體包封率的影響程度不同，各因素的影響程度依次為A＞C＞B.從表3可知：枇杷葉黃酮脂質(zhì)體的最佳處方為A3B3C1，即卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，卵磷脂與黃酮的質(zhì)量比為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為5.8.

表3 黃酮脂質(zhì)體制備的正交試驗結(jié)果Tab.3 Orthogonal experiment results of the preparation of flavonoids liposomes

表4 黃酮脂質(zhì)體制備的方差分析Tab.4 Variance analysis of the preparation of flavonoids liposomes

按最優(yōu)處方進行黃酮脂質(zhì)體制備的正交實驗驗證，結(jié)果表明，黃酮脂質(zhì)體制備試驗的5次黃酮包封率平均值為51.45%，相對標準偏差值為1.44%，重現(xiàn)性較好.

2.3 枇杷葉黃酮及其脂質(zhì)體的抗氧化性能

不同抗氧化劑對豬油的抗氧化性能［18］，如圖2所示.從圖2可以看出，添加了不同劑量的黃酮及黃酮脂質(zhì)體組，相對于空白對照組，均呈現(xiàn)不同的抗氧化活性；隨著添加劑量的增加，過氧化值減小，顯示抗氧化性增強.當黃酮的添加劑量為0.5%時，其抗氧化作用強于添加劑量為0.05%的TBHQ；在質(zhì)量分數(shù)相同的前提下，黃酮脂質(zhì)體的抗氧化效果明顯優(yōu)于黃酮溶液.此外，質(zhì)量分數(shù)為0.5%黃酮脂質(zhì)體與質(zhì)量分數(shù)為0.02%的抗壞血酸（Vc）混合物的抗氧化效果最好，表明黃酮脂質(zhì)體與抗壞血酸（Vc）復(fù)配后，對豬油具有較好的抗氧化協(xié)同增效作用.

3 結(jié)論

實驗以總黃酮提取率為指標，考察了4種影響因素，得到枇杷葉黃酮類化合物提取最佳工藝條件：乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶60，提取溫度為80℃，提取時間為1.5h.其中，乙醇質(zhì)量分數(shù)對黃酮的提取率有顯著性影響.以包封率為衡量指標，對總黃酮脂質(zhì)體的處方進行優(yōu)化，得出枇杷葉黃酮脂質(zhì)體的最佳處方：卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，卵磷脂與黃酮的質(zhì)量比為20∶1，磷酸鹽緩沖液pH值為5.8.

抗氧化實驗結(jié)果顯示，不同濃度的黃酮及其脂質(zhì)體對豬油都具有一定的抗氧化作用，且隨著添加劑量的增加抗氧化能力增強.當質(zhì)量分數(shù)相同時，黃酮脂質(zhì)體的抗氧化效果明顯好于黃酮溶液.究其原因可能是，脂質(zhì)體的制備增加了黃酮的穩(wěn)定性，減少其在體外的自身氧化作用，使其顯示出比黃酮溶液具有更強的抗氧化效應(yīng).

圖2 不同抗氧化劑對豬油的抗氧化性能Fig.2 Antioxidant effect of different antioxidants on lard oil

通過正交試驗設(shè)計，優(yōu)選乙醇回流法提取枇杷葉總黃酮的最佳工藝，為工業(yè)提取批把葉總黃酮工藝提供依據(jù).對枇杷葉中黃酮類化合物的提取及其脂質(zhì)體制備工藝的初步探討，其結(jié)果對提高枇杷葉的綜合開發(fā)利用具有一定的理論指導(dǎo)意義.

［1］劉傳安，鄒盛勤，陳武.枇杷葉化學成分藥理作用及其應(yīng)用研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2005，33（11）：2117－2118.

［2］王麗梅，余龍江 崔永明，等.桂花黃酮提取純化及抑菌活性研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（2）：717－720.

［3］鞠建華，周亮，林耕，等.枇杷葉中三萜酸類成分及其抗炎、鎮(zhèn)咳活性研究［J］.中國藥學雜志，2003，38（10）：752－757.

［4］林啟訓.枇杷葉黃酮類化合物的水浸提工藝研究［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2005，21（7）：190－193.

［5］周振，黎中良.超聲波輔助提取枇杷葉中黃酮類化合物的工藝研究［J］.玉林師范學院學報，2008，29（3）：60－64.

［6］趙榮生，嚴寶霞，候新樸.兩性霉素 B脂質(zhì)體的研制及其質(zhì)量評價［J］.中國藥學雜志，2000，35（9）：593－595.

［7］胡靜麗，陳健初.楊梅葉黃酮類化合物最佳提取工藝研究［J］.食品科學，2003，24（1）：96－99.

［8］夏書芹，許時嬰.輔酶 Q10納米脂質(zhì)體穩(wěn)定性的研究［J］.食品與機械，2006，32（3）：28－32.

［9］曹寧寧，羨菲，劉金鵬.脂質(zhì)體的制備方法及研究進展［J］.天津理工學院學報，2003，19（1）：30－35.

［10］趙海霞，郭興奎，孔德亮.脂質(zhì)體制備技術(shù)［J］.山東中醫(yī)雜志，2000，19（7）：435－437.

［11］王建華，溫浩，買爾旦，等.阿苯達唑脂質(zhì)體的包封率測定及形態(tài)觀察［J］.新疆醫(yī)學院學報，1994，1（17）：17.

［12］劉碩，仵文英，席枝俠，等.黃芩苷脂質(zhì)體包封率的測定和體外釋放度考察［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2008，28（5）：342－345.

［13］劉書成，李元瑞.大蒜精油對食用油脂的抗氧化特性［J］.食品科學，2002，23（1）：128－131.

［14］陳玉香，周道瑋.茶多酚對豆油及豬油的抗氧化作用［J］.食品科學，2001，22（11）：27－29.

［15］李書國，李雪梅，陳輝，等.油脂復(fù)合抗氧化劑抗氧化協(xié)同增效作用的研究［J］.糧油加工與食品機械，2004（4）：42－44.

［16］劉青，劉珍伶，周娟.金線蓮多糖的體外抗氧化活性［J］.華僑大學學報：自然科學版，2010，31（6）：718－720.

［17］曹艷萍.苦蕎葉提取物抗氧化性及其協(xié)同效應(yīng)的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2005，33（8）：144－148.

［18］郭江寧，翁新楚，吳侯，等.補骨脂對豬油抗氧化作用的研究［J］.中國油脂，2004，29（3）：40－41.

Studies on Flavonoids Extraction from Loquat and Their Liposomes Antioxidant Activity

HUANG Li－yan1，HAN Lei1，LIU Qing1，LIU Zhen－ling2，LI Zhen－zhen1

（1.College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；2.Chemistry and Chenical Engineering，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

Alcohol reflux was used to extract flavonoid components from loquat leaves and then the flavonoids liposomes were prepared.The antioxidant activity of the liposomes and the influence of various factors on extraction rate were investigated.During these processes，we also optimized the preparation prescription of flavonoids liposomes and then determined their antioxidant activity.The optimum extraction process as follows：70%ethanol concentration，liquid feed ratio 1∶60，extraction temperature 80℃，extraction time 1.5h.The best prescription for the flavonoids liposomes：lecithin and cholesterol ratio of 4∶1，lecithin and flavonoids ratio of 20∶1，phosphate buffer at pH 5.8.Antioxidant results in vitro showed that flavonoids with different mass ratio and their liposomes had some antioxidant effect on lard oil，and the effect increased when the dose increased.If the mass ratio was the same，the antioxidant effect of the flavonoids liposome was better than that of the flavonoids solution，and it had good antioxidant synergy effect when used with ascorbic acid.

loquat；flavonoids；liposomes；antioxidant

黃曉楠 英文審校：劉源崗）

R 284.2；TQ 289

A

1000－5013（2012）01－0055－05

2011－07－25

劉青（1970－），女，副教授，主要從事藥理學的研究.E－mail：liuq＠hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目（20972061）；國務(wù)院僑辦科研基金資助項目（10QZR15）